【3千字干货+免费试用】AAV在视网膜组织研究中的靶向策略
眼睛为人体重要而复杂的感觉器官，其核心功能是将光信号转化为神经信号，最终形成视觉。眼睛主要由角膜、房水、瞳孔、晶状体、玻璃体及视网膜等关键结构组成。
角膜为透明外层，是主要屈光介质，能够折射70%入射光；房水用于维持眼压，营养角膜、晶状体等；瞳孔用于动态调节进光量；晶状体通过睫状肌调节屈光度以便看清近、远物体；视网膜的主要功能是将光信号转换为神经信号，并通过视神经将其传递到大脑。
信号转化流程：光子 → 激活视色素（视紫红质/视锥蛋白）→ 触发级联反应 → 产生电信号 → 双极细胞 → 神经节细胞。
眼基本结构（来源：维基百科）
视网膜位于眼球最内层，作为感光信号转换的神经组织，由多层细胞构成，主要包括视网膜色素上皮细胞、视杆细胞、视锥细胞、穆勒胶质细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、神经节细胞，这些细胞层的空间分布与功能分化对药物递送途径的选择具有决定性影响[1]。深入探究并优化AAV在视网膜组织中的靶向策略——利用不同血清型及特异性启动子实现对目标视网膜细胞类型的精准递送与高效转导，是当前视网膜基因治疗研究的核心焦点与前沿突破点。
视网膜横截面示意图[1]
AAV血清型的选择
目前已开展的眼科AAV基因治疗试验多集中于眼底疾病，且靶向的细胞类型不一，如视网膜色素上皮细胞、神经节细胞和光感受器等。不同的AAV血清型具有不同的结合受体和组织趋向性，根据治疗目的不同，针对不同靶细胞及注射方式来进行血清型的选择。目前在眼科基因治疗试验中，使用的载体以AAV2、AAV5、AAV8野生型血清型居多，AAV变体如AAV2.7M8、AAV2-tYF、AAVrh10、AAV Anc80L65等也被证明能有效转导视网膜组织。
Luk H Vandenberghe[2]等研究者使用视网膜下的注射方式比较了AAV2和AAV8在食蟹猴视网膜中的转导效率，发现AAV8能更有效的转导视网膜色素上皮细胞及感光细胞（图3）。
AAV2 及 AAV8转导食蟹猴视网膜[2]
Deniz Dalkara[3]等研究者使用玻璃体腔内的注射方式，比较了AAV2.7M8和AAV2递送RPE65基因恢复Rd12小鼠视网膜功能的能力，结果表明注射AAV2.7M8-RPE65的小鼠的RPE细胞显示高水平的RPE 65表达（图4）。
不同AAV对rd12小鼠视网膜功能的恢复[3]
赛业生物利用自主搭建的AI-AAV衣壳筛选平台，经多轮次的文库筛选及验证得到视网膜转导能力增强的AAV2-PM054突变体。其经玻璃体腔注射后转导范围广，可转导80%以上视网膜区域；穿透能力强，可感染神经节细胞、双极细胞至视网膜后层的视锥和视杆等细胞，及部份RPE细胞（图5）。
AAV-PM054小鼠视网膜转导效率比较
眼睛细胞种类繁多，且具有不同的功能，可以选择特异性启动子靶向特定的细胞，进而避免在非靶向细胞中大量表达。
视网膜色素上皮细胞特异性启动子
Meur等[4]研究人员使用视网膜下注射方式，将由RPE65启动子驱动且携带hRPE65 cDNA的rAAV2/4载体注射RPE65⁻/⁻犬模型，发现可以有效靶向视网膜色素上皮细胞，恢复视网膜功能和视力（图6）。
AAV转导视网膜组织结果图（RPE：红色、视紫红质：绿色）[4]
BEST1（VMD2）基因的突变是导致多种眼科疾病如Best病（BMD）、视网膜色素变性（RP50）的主要原因。Haibo Wang等[5]研究人员在治疗脉络膜新生血管形成的实验中，通过视网膜下注射scAAV2-RPE65-GFP-CARap1a和scAAV2-VMD2-GFP-CARap1a载体，结果表明scAAV2-RPE65-GFP-CARap1a不仅转导RPE层，在视网膜神经节细胞和感光器外段均表达；而scAAV2-VMD2-GFP-CARap1a主要转导RPE层，更具特异性（图7）。
AAV转导视网膜组织结果图[5]
视网膜视杆/视锥细胞特异性启动子
Mariacarmela Allocca[6]等通过视网膜下注射的方式，评估了AAV2/5-EGFP携带CMV、CBA、RHO、RHOK不同启动子转导光感受器细胞的能力，结果表明虽然使用RHO启动子时，EGFP的表达晚于使用CMV及CBA启动子，但其在光感受器细胞转导更具特异性（图8）。
AAV转导视网膜组织结果图（PNA：视锥细胞外段，红色）[6]
GRK1（RK）主要在视杆细胞和视锥细胞中发挥作用，通过磷酸化视紫红质（rhodopsin）调节视觉信号的传递，GRK1的突变可能导致遗传性视网膜病变。IRBP编码的光感受器间类视黄醇结合蛋白负责视网膜色素上皮细胞与光感受器间的类视黄醇运输，维持视觉循环。William A Beltran[7]等通过构建AAV2/5-GRK1-eGFP及 AAV2/5-IRBP-eGFP，以视网膜下的注射方式评估IRBP和GRK1启动子在非人灵长类动物（NHP）中的转导效率。结果表明，IRBP驱动的GFP表达在中央凹区域（A1-A6）及视网膜外周（B1-B3）仅限于视杆细胞，视锥细胞未见GFP表达。GRK1驱动的GFP表达在中央视锥细胞（C1-C3）、外周视锥细胞（D1-D3 中的白色箭头）和视杆细胞（D1-D3）中表达（图9）。
AAV2/5-GRK1-eGFP及 AAV2/5-IRBP-eGFP转导视网膜组织结果图
（视锥细胞，红色）[7]
Arr3在视觉和非视觉信号传导中起到调节作用，参与视锥细胞光适应过程，Arr3的异常表达或功能障碍可能导致视觉信号传导的紊乱，影响视力。M Dominik Fischer[8]等研究者将Arr3启动子与人CNGA3互补的DNA 相结合，构建了AAV8-Arr3-CNGA3载体，通过视网膜下注射给药全色盲患者后发现，载体靶向富含锥体的黄斑，接受治疗的眼睛的视觉功能在视力、对比敏感度和色觉上均得到改善。
表1 AAV8-Arr3-CNGA3治疗全盲患者前后的临床特征[8]
视网膜穆勒细胞特异性启动子
GFAP启动子常用于胶质细胞靶向，Wendy M Aartsen[9]等研究者构建AAV2/6-GFAP-GFP载体，以玻璃体内注射方式验证能否靶向转导Crb1-/-小鼠视网膜Müller胶质细胞，结果发现AAV2/6-GFAP-GFP载体在神经胶质细胞中表达（图G、H）。
AAV2/6-GFAP-GFP转导的Crb1-/-Müller神经胶质细胞[9]
视网膜神经节细胞特异性启动子
Qizhao Wang[10]等研究者证实了小鼠γ-突触核蛋白（mSncg）启动子有效且持续的在 RGC中表达（图11）。
AAV转导视网膜组织结果图[10]
赛业生物整理了20+个高频核心问题，从血清型选择到注射技巧，从避坑指南到AI黑科技，用表格+图解为你解析重点，囊括AAV相关特性、血清型选择指南、实验关键技巧、常见问题解决方案、前沿技术应用等要点。
在眼科基因治疗中，最常见的给药方式为视网膜下注射（Subretinal injection）和玻璃体腔注射（Intravitreal injection），其他方式还包括前房内注射（Intracameral injection）、结膜下注射（Subconjunctival injection）、脉络膜上注射（Suprachoroidal injection）。玻璃体腔注射是将药物直接注入眼球玻璃体腔内，创伤小，操作简单，但易诱导体液免疫反应。视网膜下注射是将药物精准输送至RPE与光感受器间的间隙，要注意避免注射造成的出血损伤以及潜在的视网膜脱离的风险。首个被批准用于治疗由Leber先天性黑蒙RPE65缺陷引起的遗传性视网膜营养不良的rAAV基因治疗药物Luxturna即采用视网膜下的注射方式。
眼睛给药示意图[11]
表2 注射方式与剂量参考
实验前准备
麻醉小鼠：在小鼠称重后，经腹腔注射适量的1%戊巴比妥钠溶液，放置于饲养笼内，等待麻醉约5-10min。小鼠麻倒后，眼球表面滴入扩瞳剂使其散瞳。
玻璃体腔注射
用微量注射器吸取适量病毒备用，取麻醉后的小鼠置于操作台上，眼部给予盐酸利多卡因进行局部麻醉，左手按住头部，使其眼球部分突出，右手持胰岛素针在角膜缘1mm处垂直做一个预切口，再使用微量注射器自角膜后缘的切口位置插入玻璃体腔，针尖先垂直进入，随后倾斜，慢慢推注病毒。病毒注射完毕，缓慢抽出针头。
动物复苏
将小鼠放回饲养笼内，注意保温，待其苏醒。
视网膜下注射
实验前准备
麻醉小鼠：在小鼠称重后，经腹腔注射适量的1%戊巴比妥钠溶液，放置于饲养笼内，等待麻醉约5-10min。小鼠麻倒后，眼球表面滴入扩瞳剂使其散瞳。
病毒注射
用微量注射器吸取适量病毒备用，取麻醉后的小鼠置于操作台上，眼部给予盐酸利多卡因进行局部麻醉，左手按住头部，使其眼球部分突出，右手持胰岛素针在角膜缘1mm处垂直做一个预切口，再使用微量注射器自角膜后缘的切口位置插入玻璃体腔，针尖先垂直进入，随后倾斜，直至对侧视网膜（经玻璃体腔注射），有阻力时停止进针，慢慢推注病毒。或者用注射器针头与眼轴呈15°角在动物暴露出的距角膜缘1mm处开一个通道，针头斜面没入穿过巩膜和脉络膜，到达视网膜下间隙，即停止进针（经巩膜注射），慢慢推注病毒。病毒注射完毕，缓慢抽出针头。
动物复苏
将小鼠放回饲养笼内，注意保温，待其苏醒。
综上所述，针对眼底不同靶细胞采用注射方式、血清型及启动子推荐如表3所示，仅供参考。亦可选择赛业生物多血清型彩虹套装病毒注射少量动物进行预实验，根据实验需求筛选最佳血清型、注射方式及剂量。
表3 视网膜组织不同细胞AAV血清型及注射方式推荐
参考文献：
1.Xiao, Y., C.N.J. McGhee, and J. Zhang, Adult stem cells in the eye: Identification, characterisation, and therapeutic application in ocular regeneration - A review. Clin Exp Ophthalmol, 2024. 52(2): p. 148-166.
2.Vandenberghe, L.H., et al., Dosage thresholds for AAV2 and AAV8 photoreceptor gene therapy in monkey. Sci Transl Med, 2011. 3(88): p. 88ra54.
3.Dalkara, D., et al., In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Sci Transl Med, 2013. 5(189): p. 189ra76.
4.Le Meur, G., et al., Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Gene Ther, 2007. 14(4): p. 292-303.
5.Wang, H., et al., Optimal Inhibition of Choroidal Neovascularization by scAAV2 with VMD2 Promoter-driven Active Rap1a in the RPE. Sci Rep, 2019. 9(1): p. 15732.
6.Allocca, M., et al., Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol, 2007. 81(20): p. 11372-80.
7.Beltran, W.A., et al., Optimization of Retinal Gene Therapy for X-Linked Retinitis Pigmentosa Due to RPGR Mutations. Mol Ther, 2017. 25(8): p. 1866-1880.
8.Fischer, M.D., et al., Safety and Vision Outcomes of Subretinal Gene Therapy Targeting Cone Photoreceptors in Achromatopsia: A Nonrandomized Controlled Trial. JAMA Ophthalmol, 2020. 138(6): p. 643-651.
9.Aartsen, W.M., et al., GFAP-driven GFP expression in activated mouse Müller glial cells aligning retinal blood vessels following intravitreal injection of AAV2/6 vectors. PLoS One, 2010. 5(8): p. e12387.
10.Wang, Q., et al., Mouse γ-Synuclein Promoter-Mediated Gene Expression and Editing in Mammalian Retinal Ganglion Cells. J Neurosci, 2020. 40(20): p. 3896-3914.
11.He, X., et al., AAV for Gene Therapy in Ocular Diseases: Progress and Prospects. Research (Wash D C), 2023. 6: p. 0291.
12.Yang, G.S., et al., Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol, 2002. 76(15): p. 7651-60.
13.Ding, K., et al., AAV8-vectored suprachoroidal gene transfer produces widespread ocular transgene expression. J Clin Invest, 2019. 129(11): p. 4901-4911.
14.Boyd, R.F., et al., Photoreceptor-targeted gene delivery using intravitreally administered AAV vectors in dogs. Gene Ther, 2016. 23(4): p. 400.
15.Gootwine, E., et al., Safety and Efficacy Evaluation of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGA3 Vector Delivered by Subretinal Injection in CNGA3 Mutant Achromatopsia Sheep. Hum Gene Ther Clin Dev, 2017. 28(2): p. 96-107.
16.Klimczak, R.R., et al., A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Müller cells. PLoS One, 2009. 4(10): p. e7467.
17.Lebherz, C., et al., Novel AAV serotypes for improved ocular gene transfer. J Gene Med, 2008. 10(4): p. 375-82.
18.Song, L., et al., Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice. Gene Ther, 2018. 25(6): p. 402-414.
19.Giove, T.J., M. Sena-Esteves, and W.D. Eldred, Transduction of the inner mouse retina using AAVrh8 and AAVrh10 via intravitreal injection. Exp Eye Res, 2010. 91(5): p. 652-9.
