AAV(腺相关病毒)滴度的确定是AAV生产和研究中的关键步骤。以下是几种常用的AAV滴度测定方法,包括物理滴度(Physical titer)的测定方法及其原理:
1. 物理滴度(Physical titer)的测定
物理滴度是指单位体积中病毒颗粒的数量。我们通过裂解AAV病毒颗粒,然后以qPCR测定裂解产物中的AAV基因组拷贝数(ITR区域的拷贝数)来获取AAV的物理滴度。以下是具体步骤:
(1)病毒颗粒裂解
• 裂解液处理:将AAV病毒颗粒与裂解液混合,使病毒颗粒破裂,释放出病毒基因组DNA。
• DNase处理:使用DNase I处理裂解产物,去除可能存在的游离DNA,确保检测到的是病毒基因组DNA。
(2)qPCR测定
• 引物和探针设计:设计特异性引物和探针,针对AAV基因组中的ITR区域进行扩增。
• 标准曲线制备:制备一系列已知浓度的AAV基因组标准品,通过qPCR测定其Ct值,生成标准曲线。
• 样品测定:将裂解后的样品进行qPCR测定,根据标准曲线计算样品中AAV基因组拷贝数。
• 计算滴度:根据测得的基因组拷贝数和样品体积,计算AAV的物理滴度。
2. 其他滴度测定方法
除了物理滴度测定,还有其他几种滴度测定方法可供选择:
(1)基因组拷贝数(Genome copies,GC):通过qPCR测定AAV基因组拷贝数,反映病毒颗粒的数量。操作简便,结果稳定,适用于高通量检测。
(2)目的基因(Gene of Interest,GOI)拷贝数:通过qPCR测定AAV载体中目的基因的拷贝数。可以直接反映目的基因的表达情况。
(3)数字PCR(Droplet Digital PCR,ddPCR):ddPCR通过将样品分散成数万个纳升体积的微滴,每个微滴独立进行PCR反应,通过荧光信号的有无来判断每个微滴中是否存在目标DNA。无需标准曲线,绝对定量,灵敏度高。
(4)TCID50(半数组织培养感染剂量):通过将病毒液稀释后接种到细胞培养物中,观察细胞病变情况,计算出能够引起50%细胞感染的病毒最低浓度。反映病毒的感染能力,适用于不形成空斑的病毒。
3. 选择合适的滴度测定方法
• 物理滴度:适用于需要快速、高通量测定病毒颗粒数量的场景。
• 基因组拷贝数:适用于需要精确测定病毒基因组数量的场景。
• 目的基因拷贝数:适用于需要评估目的基因表达情况的场景。
• 数字PCR:适用于需要高灵敏度、绝对定量的场景。
• TCID50:适用于需要评估病毒感染能力的场景。
AAV滴度的测定方法多样,选择合适的方法取决于研究目的和实验需求。物理滴度测定通过qPCR测定AAV基因组拷贝数,操作简便,结果稳定。其他滴度测定方法如GOI拷贝数、ddPCR、TCID50等,可根据具体需求选择。我们提供多种滴度测定方式,以满足不同客户的需求。