AAV（腺相关病毒）滴度的确定是AAV生产和研究中的关键步骤。以下是几种常用的AAV滴度测定方法，包括物理滴度（Physical titer）的测定方法及其原理：

1. 物理滴度（Physical titer）的测定
物理滴度是指单位体积中病毒颗粒的数量。我们通过裂解AAV病毒颗粒，然后以qPCR测定裂解产物中的AAV基因组拷贝数（ITR区域的拷贝数）来获取AAV的物理滴度。以下是具体步骤：

（1）病毒颗粒裂解

• 裂解液处理：将AAV病毒颗粒与裂解液混合，使病毒颗粒破裂，释放出病毒基因组DNA。

• DNase处理：使用DNase I处理裂解产物，去除可能存在的游离DNA，确保检测到的是病毒基因组DNA。

（2）qPCR测定

• 引物和探针设计：设计特异性引物和探针，针对AAV基因组中的ITR区域进行扩增。

• 标准曲线制备：制备一系列已知浓度的AAV基因组标准品，通过qPCR测定其Ct值，生成标准曲线。

• 样品测定：将裂解后的样品进行qPCR测定，根据标准曲线计算样品中AAV基因组拷贝数。

• 计算滴度：根据测得的基因组拷贝数和样品体积，计算AAV的物理滴度。

2. 其他滴度测定方法
除了物理滴度测定，还有其他几种滴度测定方法可供选择：

（1）基因组拷贝数（Genome copies,GC）：通过qPCR测定AAV基因组拷贝数，反映病毒颗粒的数量。操作简便，结果稳定，适用于高通量检测。

（2）目的基因（Gene of Interest,GOI）拷贝数：通过qPCR测定AAV载体中目的基因的拷贝数。可以直接反映目的基因的表达情况。

（3）数字PCR（Droplet Digital PCR,ddPCR）：ddPCR通过将样品分散成数万个纳升体积的微滴，每个微滴独立进行PCR反应，通过荧光信号的有无来判断每个微滴中是否存在目标DNA。无需标准曲线，绝对定量，灵敏度高。

（4）TCID50（半数组织培养感染剂量）：通过将病毒液稀释后接种到细胞培养物中，观察细胞病变情况，计算出能够引起50%细胞感染的病毒最低浓度。反映病毒的感染能力，适用于不形成空斑的病毒。

3. 选择合适的滴度测定方法

• 物理滴度：适用于需要快速、高通量测定病毒颗粒数量的场景。

• 基因组拷贝数：适用于需要精确测定病毒基因组数量的场景。

• 目的基因拷贝数：适用于需要评估目的基因表达情况的场景。

• 数字PCR：适用于需要高灵敏度、绝对定量的场景。

• TCID50：适用于需要评估病毒感染能力的场景。

AAV滴度的测定方法多样，选择合适的方法取决于研究目的和实验需求。物理滴度测定通过qPCR测定AAV基因组拷贝数，操作简便，结果稳定。其他滴度测定方法如GOI拷贝数、ddPCR、TCID50等，可根据具体需求选择。我们提供多种滴度测定方式，以满足不同客户的需求。