Nucleic Acids Research
thermostable Cas12a工程化提升核酸检测性能
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该研究通过结构引导的蛋白质工程和DNA结合域融合策略，显著提升YmeCas12a的trans切割效率，为开发高效、耐高温的Cas12a-LAMP单管核酸检测系统奠定基础。
CRISPR-Cas12a系统因其cis DNA识别和trans非特异性RNAse活性，在核酸检测中展现出广泛应用潜力。然而，目前常用的Cas12a蛋白来源于常温细菌，热稳定性差，限制了其与高温LAMP扩增反应的整合。LAMP扩增通常在60–65°C下进行，而野生型Cas12a在该温度下失活，因此需要复杂的两管操作流程，增加污染风险并延长检测时间。为解决这一问题，研究团队转向来源于高温环境的YmeCas12a，虽然该蛋白具有良好的热稳定性，但其trans切割效率远低于LbaCas12a。本研究通过系统性结构比对、点突变工程和DNA结合蛋白融合策略，成功开发出具备高效trans切割活性且耐受高温的Cas12a变体，为单管核酸检测提供新思路。
Cas12a蛋白的trans切割活性在核酸检测中起关键作用，其效率依赖于蛋白与trans底物的结合能力。研究首先比较了YmeCas12a和LbaCas12a的trans切割动力学，发现YmeCas12a的Km显著高于LbaCas12a，表明其底物结合能力较弱，而kcat则相对接近。这一结果说明YmeCas12a的trans活性受限于其对trans底物的低亲和力。为改善其结合能力，研究团队基于结构分析，将YmeCas12a的HLH结构域替换为LbaCas12a的同源区域，构建嵌合体YmeHLH。该变体的trans切割效率提高约2倍，且不影响cis切割活性。进一步引入正电荷富集的点突变（如G1019K和I1155R）或融合DNA结合蛋白（如Sso7d或ET-SSB）至Cas12a的N端或C端，均能不同程度提升trans切割效率。组合突变G1019K/I1155R与N端ET-SSB融合的三重突变体表现出最优trans切割效率，其Km降低近20倍，kcat提升至接近LbaCas12a水平。最终，该工程化变体在LAMP-Cas12a单管检测体系中展现出5–50倍的检测灵敏度提升，可实现5拷贝/μl的RNA检测灵敏度，为现场快速检测提供了高效、稳定的Cas12a变体。
通过结构比对和蛋白质工程，本研究成功改造YmeCas12a的HLH结构域和RuvC/Nuc结构域，使其trans切割效率显著提升。引入正电荷突变和DNA结合蛋白融合策略不仅提高了蛋白对trans底物的亲和力，还保持cis识别的特异性。最终构建的工程化YmeCas12a变体（en-Yme）在高温下仍能高效激活并切割荧光报告底物，使得LAMP扩增与Cas12a检测可在同一反应中完成，极大简化操作流程并提升检测灵敏度。该研究为开发适用于现场快速检测（POCT）的Cas12a系统提供了重要工程化策略，也为其他Cas12a蛋白的优化提供通用路线。
