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天津医科大学余秋景教授等团队揭示MTHFD2通过抑制PTEN调控巨噬细胞极化
2023-10-21

巨噬细胞在体内发挥着不同的功能,以响应各种微环境刺激。近年来研究发现,巨噬细胞可根据微环境的变化而改变其表型,这被称为巨噬细胞极化。M1型巨噬细胞通常由IFN-γ或LPS或TNF-α激活,具有细胞毒性、促炎和抗肿瘤功能。M2型巨噬细胞则由IL-4或IL-13或IL-10交替激活,发挥清除寄生虫、抗炎和促肿瘤作用。

 

巨噬细胞的极化受转录因子、信号级联和代谢重编程的调控。一碳(1C)代谢包括叶酸循环和蛋氨酸循环等,在多种生理过程中发挥重要作用。一碳代谢酶MTHFD2(亚甲基四氢叶酸脱氢酶2)参与了肿瘤发生和免疫细胞功能的调控,但它是否能调控巨噬细胞极化目前仍是一个未知数。

 

近日,天津医科大学基础医学院免疫系余秋景教授(现为电子科技大学附属医院·四川省人民医院健康管理中心教授)和药理系王霆教授以及天津医科大学第二医院陈兵教授领导的团队通过研究发现,MTHFD2是巨噬细胞极化的调节因子。它通过与PTEN催化中心相互作用调节PTEN活性,从而对巨噬细胞极化进行重编程。这项成果发表在《Cell Reports》杂志上,表明操控MTHFD2可作为一种策略来调节巨噬细胞介导的免疫反应。

 

图片来源:《Cell Reports》

(https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.112481)

 

研究材料

在此次研究中,研究人员将赛业生物提供的Mthfd2fl/fl小鼠与Lyz2-Cre小鼠杂交,培育出髓系细胞特异性MTHFD2敲除小鼠(MTHFD2-KO-Mφ小鼠)。在此基础上,通过构建CCl4诱导的肝纤维化模型、甲壳素模型和肿瘤移植模型。他们从小鼠身上采集骨髓,并使其分化为骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)。他们通过免疫沉淀分析检测到MTHFD2与PTEN的相互作用,并通过ClusPro蛋白对接分析、链霉亲和素pull down和表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)等实验确定了相互作用结构域和关键位点。

 

技术路线

1. 通过体外实验探究MTHFD2如何调控小鼠巨噬细胞的极化

2. 通过多个模型确定MTHFD2在体内可抑制M1型巨噬细胞极化,并促进M2型极化

3. 通过对Akt信号转导的分析发现MTHFD2可抑制PTEN的PIP3磷酸酶活性

4. 蛋白相互作用分析表明,MTHFD2(aa 215-225)直接靶向PTEN催化中心(aa 118-141),且D168残基对这种相互作用很重要

 

研究结果

MTHFD2在体外和体内调节巨噬细胞的极化

研究人员首先分析了MTHFD2的表达和功能是否与巨噬细胞极化有关。在M1和M2极化模型中,MTHFD2的表达均升高,表明它可能是巨噬细胞极化的重要调节因子。利用siRNA抑制小鼠巨噬细胞系RAW264.7中的MTHFD2后,M1型标志物Nos2和Il-6表达显著上调,而M2型标志物Arg1和Retnla表达显著下调。

 

研究人员将赛业生物提供的Mthfd2fl/fl小鼠与Lyz2-Cre小鼠杂交,培育出髓系细胞特异性MTHFD2敲除小鼠(MTHFD2-KO-Mφ小鼠)。他们发现,与WT小鼠(MTHFD2-WT-Mφ小鼠)相比,KO小鼠(MTHFD2-KO-Mφ小鼠)BMDMs中的M1型标志物上调,而M2型标志物被抑制。MTHFD2过表达则抑制M1型标志物,但增强M2型标志物表达。这些结果表明,MTHFD2可以调节巨噬细胞的极化。

 

为了进一步研究髓系MTHFD2是否调节体内巨噬细胞的极化,研究人员在MTHFD2-KO-Mφ和MTHFD2-WT-Mφ小鼠上建立了肿瘤移植模型。与WT小鼠相比,KO小鼠的肿瘤生长较慢,肿瘤切片中的F4/80+巨噬细胞数量增加了近2倍(图1)。表达iNOS的细胞数量明显增加,而表达ARG1的细胞数量减少,这表明Mthfd2缺失会促进M1型巨噬细胞极化,并抑制M2型巨噬细胞极化。

 

由于表达ARG1的巨噬细胞在促进纤维化缓解方面发挥重要作用,故研究人员利用CCl4诱导的肝纤维化模型来分析MTHFD2在调节M2表型上的作用。MTHFD2缺失导致ARG1阳性的巨噬细胞显著减少,表明MTHFD2对M2表型有正向调节作用。此外,通过甲壳素模型的分析,他们发现髓系MTHFD2缺失会减少嗜酸性粒细胞的招募并降低ARG1的表达,进一步提示了MTHFD2在促进M2型巨噬细胞功能上发挥重要作用。

 

图1 MTHFD2在体内调节肿瘤相关巨噬细胞的极化[1]

 

MTHFD2抑制PTEN的PIP3磷酸酶活性

之前的研究发现,Akt-mTORC1信号传导对IL-4诱导的M2型极化至关重要。有意思的是,在MTHFD2-KO BMDM中,AktS473和AktT308的基础磷酸化及IL-4诱导的磷酸化都明显减弱。那么,Akt激活的减少是否与M2型极化缺陷有关?研究人员用Akt激活剂SC79处理MTHFD2-KO BMDM后,发现巨噬细胞极化的缺陷得以挽救,表明Akt信号转导对MTHFD2缺失诱导的异常极化很关键。

 

蛋白激酶PI3K和PTEN可通过平衡PIP3的浓度来调节Akt的激活。他们发现,在经过IL-4和IFN-γ处理的MTHFD2-KO和WT细胞中,PI3K的表达和活性相当,PTEN表达也相当。然而在基础条件和IL-4处理条件下,MTHFD2-KO细胞中PTEN的PIP3磷酸酶活性均高于WT细胞。与此相一致的是,PTEN的敲除可明显挽救MTHFD2-KO细胞中的Akt磷酸化。综上,这些结果表明,MTHFD2抑制了PTEN的PIP3磷酸酶活性,从而促进了Akt的激活。

 

MTHFD2直接靶向PTEN催化中心

通过共聚焦免疫荧光显微镜观察和免疫沉淀分析,研究人员发现MTHFD2能够与PTEN发生相互作用。通过构建MTHFD2的N端缺失突变体(缺少线粒体靶向信号),他们发现MTHFD2与PTEN的结合以及PTEN的PIP3磷酸酶活性和Akt信号转导均不受影响。此外,IL-4刺激明显增强了这种相互作用,而IFN-γ处理则没有。由此可见,线粒体定位并不是MTHFD2与PTEN结合的必要条件,且IL-4处理促进了这种相互作用。

 

通过ClusPro蛋白对接分析,他们进一步发现MTHFD2的氨基酸残基(aa 215-225)可直接靶向PTEN的催化中心(aa 118-141)(图2)。链霉亲和素pull-down和SPR分析发现,合成的PTEN(aa 118-141)生物素肽段能够与胞内或重组MTHFD2蛋白相互作用。同样地,MTHFD2(aa 215-225)生物素肽段也能与胞内或重组PTEN蛋白相互作用。与WT MTHFD2相比,缺乏aa 215-225的MTHFD2能够显著减少PTEN的PIP3磷酸酶活性降低。这些结果表明,MTHFD2直接靶向PTEN催化中心以降低PTEN的PIP3磷酸酶活性。

 

图2 MTHFD2直接靶向PTEN催化中心并抑制PTEN的PIP3磷酸酶活性[1]

 

MTHFD2需要无机磷酸盐和镁离子来支持其依赖于NAD的脱氢酶活性,而以往的研究发现MTHFD2 D168是镁离子结合位点,而R201是无机磷酸盐与NAD结合的主要位点。因此,研究人员通过突变分析来确定这些结合位点对MTHFD2与PTEN相互作用的重要性。他们发现,D168E突变体与PTEN的结合明显减少。在MTHFD2-KO BMDM中,过表达MTHFD2可使M1型和M2型标志物恢复到WT细胞的水平,但过表达D168E突变体只能部分恢复表型。从这些结果可以看出,MTHFD2 D168对于MTHFD2与PTEN的结合并抑制PTEN的PIP3磷酸酶活性很关键。

 

研究结论

图3 MTHFD2调节巨噬细胞极化的机理示意图[1]

 

总的来说,这项研究通过体外和体内研究揭示了MTHFD2的一个重要非代谢功能:它通过与PTEN的催化中心相互作用来调节PTEN活性,从而重编程巨噬细胞极化并改变巨噬细胞介导的免疫反应(图3)。它表明调控MTHFD2可作为一种策略来调节巨噬细胞介导的免疫反应。

 

原文检索:

[1]Shang, M., Ni, L., Shan, X., et al. MTHFD2 reprograms macrophage polarization by inhibiting PTEN. Cell Rep. 2023 May 30;42(5):112481. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.112481

文献解读
巨噬细胞
肿瘤
免疫细胞