内质网(ER)是蛋白质生物合成和折叠的场所,也是蛋白质发生糖基化修饰和裂解的场所。同时,它还是细胞内钙离子浓度的调节器,而钙离子在许多生理过程中发挥着重要作用,如心脏和肌肉收缩、神经信号传导、细胞增殖和凋亡等。
内质网通过兰尼碱受体(RyR)和三磷酸肌醇受体(IP3R)释放钙离子,并通过质子泵SERCA回收钙离子。钙离子跨内质网膜的流动会带来电势变化,需要其他离子来中和这种电荷积累。目前已经证实内质网钾离子通道TRIC的存在,但一价钾离子无法同时抵消二价钙离子释放产生的电势差。因此,科学家们推测内质网上同时存在一个阴离子通道,但一直未找到。
近日,清华大学医学院贾怡昌团队、中科院上海药物研究所高召兵团队和北京大学第三医院樊东升团队合作,首次证实CLCC1正是内质网定位的氯离子通道的孔道形成组分。它能够协助内质网的钙离子释放并调节内质网的离子稳态,而CLCC1功能缺失会造成内质网胁迫,并引发与肌萎缩性侧索硬化症(ALS)相关的病理变化。
这篇题为“Disruption of ER ion homeostasis maintained by an ER anion channel CLCC1 contributes to ALS-like pathologies”的论文于5月4日发表在《Cell Research》杂志上,并作为研究亮点(Research Highlight)被重点推荐。
图片来源:《Cell Research》
(https://www.nature.com/articles/s41422-023-00798-z)
研究材料与方法
在这项研究中,研究人员使用了293FT细胞和小鼠原代神经元,并构建了多个突变敲入小鼠品系。研究人员还利用赛业生物提供的Clcc1 floxed小鼠,构建了条件性敲除Clcc1小鼠。他们利用多个探针测定了内质网中的静息态氯离子、钾离子和钙离子浓度,并利用透射电镜(TEM)观察了内质网结构。他们还通过电生理学、钙成像等一系列实验验证了CLCC2突变对功能的影响。
技术路线
01通过单通道电生理检测确认CLCC1是阴离子通道的孔道形成组分,并发现抑制钙离子活性的关键残基
02探究CLCC1如何调节内质网中氯离子、钾离子和钙离子的稳态
03分析与ALS相关的罕见突变如何影响CLCC1通道活性
研究结果
1 CLCC1是内质网上阴离子通道的孔道形成组分
之前的研究发现,内质网驻留蛋白CLCC1的缺失会造成内质网胁迫和神经退行性变。不过CLCC1与氯离子通道CLIC家族成员的序列相似性很小。在此次研究中,研究人员证实CLCC1定位在内质网膜上,并形成了同源二聚体。将纯化的全长mCLCC1蛋白加入脂质双分子层后,他们发现CLCC1可以介导阴离子流,但不通透纳、钾、钙等阳离子。这表明,CLCC1是阴离子通道的孔道形成组分。
研究人员进一步分析后发现,内质网腔内的高浓度钙离子会抑制CLCC1通道的活性。为了确定负责钙离子抑制的关键残基,他们对N端几个保守的带负电残基进行了分析,发现D25和D181是负责CLCC1通道的钙离子抑制活性的关键残基。D25E/D181R突变的CLCC1会显著破坏与钙离子的结合亲和力。
2 CLCC1调节内质网中多种离子的稳态
为了研究CLCC1是否参与调节内质网的离子稳态,研究人员使用了内质网定位的比率型氯离子探针(RaMorideER)和比率型钾离子探针(RaMssiumER)。他们发现,在敲低293FT细胞的CLCC1后,内质网中的静息态氯离子浓度([Cl–]ER)和钾离子浓度([K+]ER)升高。通过透射电镜(TEM)观察,他们发现对照组的内质网呈现细长结构,而CLCC1敲低后内质网则呈现短而粗的形态,且内质网的平均宽度增加(图1)。这些结果表明,CLCC1维持着内质网中氯离子和钾离子浓度以及内质网的形态。
图1 CLCC1的缺失导致静息态[Cl–]ER和[K+]ER升高以及内质网肿胀[1]
接着,研究人员分析了CLCC1作为内质网的氯离子通道是否参与调节钙离子的释放。他们发现,CLCC1的敲低不仅显著降低了ATP诱导的钙离子释放幅度和速度,还削弱了细胞质中的钙震荡。后续的分析表明,CLCC1的敲低以剂量依赖性的方式增加了内质网中的钾离子浓度和内质网容量,并降低了钙离子浓度,说明CLCC1的剂量对于维持静息态钙离子浓度([Ca2+]ER)至关重要。
作为许多离子通道的必要辅因子,细胞膜上的酸性磷脂PIP2参与了离子通道功能的调节。在此,研究人员也发现,PIP2显著促进了CLCC1通道的活性,而CLCC1第二个环内的保守残基K298是关键的PIP2结合位点。突变体K298A和K298E降低了CLCC1的电导率和开放概率。K298A基因敲入小鼠的大脑表现出内质网胁迫,而且脊髓中ChAT+运动神经元数量减少,并表现出严重的运动障碍和后腿肌肉无力,这表明K298A突变对通道功能的破坏会促进内质网胁迫和运动神经元丢失。
3 与ALS相关的罕见突变破坏CLCC1通道活性
通过中国ALS患者队列的外显子组测序分析,研究人员发现了CLCC1的8个罕见变异,包括S263R和W267R。与对照相比,带有S263R或W267R突变的CLCC1增加了内质网中的氯离子浓度,表明S263R和W267R是功能上的有害改变,会破坏通道活性。同时,突变会显著减少ATP诱导的钙离子释放。在S263R和W267R基因敲入小鼠中,研究人员还观察到错误折叠蛋白在丘脑和脊髓中积累,显示了突变神经元更容易出现内质网胁迫。
图2 S263R和W267R突变破坏CLCC1通道功能并促进内质网胁迫[1]
多个Clcc1功能缺失等位基因的表型比较显示,体内疾病表型的严重程度与CLCC1的剂量有关。10%的K298A杂合小鼠出现了类似ALS的症状,表明功能缺失突变以显性失活的方式诱导了离子通道病。在敲除脊髓ChAT+运动神经元中的Clcc1后,小鼠出现运动神经元减少、内质网胁迫、错误折叠蛋白积累以及脊髓ALS特征性病变。
研究结论
总的来说,研究人员首次确定CLCC1是内质网定位的氯离子通道的孔道形成组分,其通道活性受到腔内钙离子的抑制,但受到PIP2的促进。他们还首次将罕见的CLCC1突变与ALS联系起来,并证明ALS相关突变会破坏CLCC1通道活性,破坏内质网的离子稳态,并引发大脑中的内质网胁迫。这些结果意味着,由CLCC1维持的内质网离子稳态的破坏是造成神经退行性疾病的原因之一。
原文检索:
[1]Guo, L., Mao, Q., He, J. et al. Disruption of ER ion homeostasis maintained by an ER anion channel CLCC1 contributes to ALS-like pathologies. Cell Res 33, 497–515 (2023). https://doi.org/10.1038/s41422-023-00798-z