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AAV-Eye病毒变体
AAV-Eye病毒变体
通过AI筛选后的AAV2病毒变体PM077、PM021、PM054在C57BL/6J小鼠中进行玻璃体腔注射,数据显示病毒变体对眼睛的感染能力强,适用于各类眼底疾病的基础和应用研究。
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AAV2-WT
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阳性对照
AAV2.7M8
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2
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创新型AAV2病毒变体1
PM077
3
10
订购
创新型AAV2病毒变体2
PM021
1.5
12.5
订购
创新型AAV2病毒变体3
PM054
10
15
订购
AAV2病毒变体验证数据
利用赛业生物AI-AAV平台,通过构建高库容突变体质粒文库、包装病毒文库、NGS测序,搭建DualConvLSTM网络构建AAV2产量预测模型,经在测试集上验证模型可信度较高,相关性已达Pearson=0.929,Spearman=0.859(图1);AI构建的视网膜靶向性模型,在测试集上相关性达Pearson=0.874,Spearman=0.871(图2)。
图1. 产量预测模型在测试集上的相关性
图2. 视网膜靶向性模型在测试集上的相关性
利用产量模型和视网膜靶向性AI模型预测产量和表达能力综合评分高的变体,挑选Top序列,构建RC突变体质粒与AAV2野生型质粒、7M8质粒分别包装Luciferase病毒,经病毒包装、纯化、QPCR滴度检测,3个变体的产量均高于AAV2和AAV2.7M8,其中PM054产量最高为AAV2的3.48倍,PM021和PM077产量分别是AAV2的1.5倍和2.01倍。
图3. AI预测AAV2变体的真实病毒产量(三质粒贴壁293系统)
将包装的Luciferase病毒玻璃体腔注射小鼠,注射剂量为3E+9vg/只眼,3W后通过活体成像和化学发光法检测Luciferase表达情况。活体成像(图4)显示,3个变体Lucifersae信号强度均高于AAV2和AAV2.7M8。为了对其进行更准确的定量,处死小鼠摘取眼球,匀浆后进行化学发光检测,PM054变体Lucifersae表达量最高,为AAV2的15倍,PM021和PM077分别为AAV2的12.5倍和10倍。
图4. 体内验证全眼表达能力(活体成像)
图5. 体内验证全眼表达能力(化学发光)
为了进一步验证变体体内感染效果并探究感染的细胞类型,包装EGFP病毒,玻璃体腔注射小鼠(3E+9vg/只眼),3W后通过活荧光眼底拍照检测EGFP整体表达情况,摘取眼球进行病理检测。眼底拍照结果(图6)显示,PM054的GFP信号最强,3种变体荧光信号均显著高于AAV2和AAV2.7M8。
图6. 体内验证全眼感染能力(眼底拍照)
对眼球冰冻切片进行DAPI染色,结果显示,3种突变体的感染范围均大于AAV2-WT和AAV2.7M8,其中PM021和PM054几乎可以感染整圈视网膜区域。从感染层次看,AAV2-WT仅感染RGC层细胞,AAV2.7M8具有一定的穿透能力,可穿透至视网膜后层感染少量的视神经细胞。3种变体穿透能力均强于AAV2-WT和AAV2.7M8,能感染视网膜从RGC到PRC的各层细胞,其中PM054对视神经细胞的感染率和表达效果最好,感染视网膜后层的能力约为AAV2.7M8的10倍。
图7. 体内验证全眼表达能力及视网膜后层穿透能力
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