Nucleic Acids Research
ARCUS核酸酶介导高效基因插入技术

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本研究揭示了ARCUS核酸酶在基因组编辑中的高效性与灵活性，其3′单链DNA粘性末端可显著促进同源重组介导的转基因插入，适用于包括T细胞和原代肝细胞在内的多种细胞类型。

 

文献概述
本文《High-efficiency homology-directed insertion into the genome using the engineered homing endonuclease ARCUS》，发表于Nucleic Acids Research杂志，回顾并总结了基因编辑工具ARCUS在实现高效HDR介导的基因插入中的作用机制及其在不同细胞类型中的应用潜力。

背景知识
基因编辑技术如CRISPR/Cas9、ZFN和TALEN等，已被广泛应用于基因敲除和修复突变基因，但其介导的HDR效率在非分裂或难以转染的细胞中仍然较低。此外，小片段编辑工具如base editor和prime editor虽然能够实现精确的碱基编辑，但受限于编辑长度或效率，难以满足大片段插入或替换的需求。而ARCUS核酸酶通过产生4-nt 3′单链粘性末端，能够高效激活同源重组修复机制，从而在T细胞和原代肝细胞中实现高达60%-90%的插入效率。这一机制为基因治疗中大片段DNA修复提供了一种新的策略，尤其是在非分裂细胞中，为目前难以实现的基因替换疗法提供了可能的解决方案。

 

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研究方法与实验
研究团队通过构建不同同源臂（HA）长度的AAV6修复模板，并结合ARCUS核酸酶在T细胞和原代肝细胞（PHH）中进行基因插入实验。此外，通过引入DNA修复通路抑制剂，评估HDR和NHEJ在不同条件下的贡献。纳米孔长读长测序和ddPCR技术被用于精确分析插入效率及修复路径。同时，还测试了ARCUS核酸酶在不同基因组位点（如TRAC、TGFBR2、HAO1）的通用性与特异性。

关键结论与观点

• ARCUS核酸酶在基因组编辑中展现出高效的HDR介导的插入能力，在T细胞中可实现高达90%的插入效率。
• 3′单链DNA过挂是HDR高效率的关键因素，缺失该结构会导致插入效率显著下降。
• 在非分裂细胞如原代肝细胞中，ARCUS同样能实现30%-40%的高效插入，这表明其可能通过非经典HDR通路（如SDSA）实现修复。
• 研究发现，HDR介导的插入并不依赖完全匹配的同源臂，1-10 bp的错配仍可实现有效整合，为基因修饰提供了更大的灵活性。
• ARCUS核酸酶可实现小片段插入、缺失、点突变及大片段替换，其编辑范围远超传统编辑工具。

研究意义与展望
本研究为基因治疗提供了高效、可编程的基因插入工具，尤其在慢病毒或非分裂细胞中，其HDR效率显著高于传统方法。未来，该技术可能在治疗隐性或显性遗传病、肿瘤免疫治疗、代谢疾病模型构建等方面发挥更大作用。此外，结合AI辅助设计，该系统有望在基因治疗、抗体开发及合成生物学中拓展应用。

 

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结语
本文系统分析了ARCUS核酸酶在基因组编辑中的高效HDR机制，其3′单链粘性末端显著促进精确基因插入，适用于分裂与非分裂细胞类型。研究还表明，同源臂无需完美匹配即可高效整合，这为基因治疗提供了更广泛的设计自由度。与传统CRISPR系统相比，ARCUS在HDR效率、插入特异性及细胞适用性方面展现出显著优势，为遗传病、代谢疾病及肿瘤相关基因治疗提供了新的技术路径。未来，该工具有望与AI辅助AAV筛选、基因治疗CRO服务等结合，进一步推动基因编辑在临床中的应用。

 

Laura Christian Resly, Alan L Tubbs, Alexander J Vogel, J Jeff Smith, and Aaron J Martin. High-efficiency homology-directed insertion into the genome using the engineered homing endonuclease ARCUS. Nucleic Acids Research.