Nucleic Acids Research
一种高通量单分子平台研究DNA超螺旋对蛋白质–DNA相互作用的影响

小赛推荐：

该研究开发了一种高通量单分子平台，用于研究DNA超螺旋对CRISPR–Cas9和错配修复蛋白MutS的影响。负超螺旋显著增强CRISPR–Cas9的脱靶效应，而正负超螺旋均可促进MutS与错配碱基的结合，为蛋白质–DNA相互作用的调控提供了新视角。

 

文献概述
本研究通过单分子荧光共振能量转移（smFRET）和TIRF显微镜，系统评估了DNA超螺旋状态对CRISPR–Cas9介导的DNA解链及MutS结合错配碱基的影响。实验设计允许在生理相关超螺旋水平下实时监测蛋白质–DNA动态，揭示了超螺旋在调节DNA代谢通路中的潜在作用。

背景知识
DNA超螺旋是DNA双螺旋结构在细胞内的重要调控机制，影响DNA复制、转录及修复等过程。超螺旋可由转录或复制过程产生，并通过拓扑异构酶调节。传统方法如电泳仅能间接分析DNA超螺旋状态，而单分子技术可直接观测超螺旋对蛋白质结合及动力学的影响。本研究利用单分子FRET技术，建立了一种高效、可重复的超螺旋DNA制备方法，为蛋白质–DNA相互作用研究提供了一种通用工具。

 

提供标准化动物模型繁育与表型分析服务，支持多种疾病机制及药物筛选研究。

了解更多

 

研究方法与实验
研究人员通过限制性内切酶BbvCI和BsmI在pUC19质粒中引入切口，随后用荧光标记或生物素修饰的单链DNA替换原始片段，实现位点特异性标记。质粒经DNA连接酶连接后，通过T5核酸酶处理去除未连接产物。不同超螺旋状态的质粒通过DNA旋转酶或反向旋转酶处理获得。通过二维凝胶电泳测定超螺旋密度（σ），发现负超螺旋（σ = −0.07）和正超螺旋（σ = +0.03）均可稳定存在。

在CRISPR–Cas9实验中，研究人员通过FRET信号变化实时监测DNA解链动力学。在MutS实验中，Cy3标记的MutS与Cy5标记的质粒结合，通过FRET变化评估其结合及构象变化。利用隐藏马尔可夫模型分析，量化结合时间和解离速率，从而解析超螺旋对MutS结合的影响。

关键结论与观点

• 负超螺旋显著增强Cas9在错配位点的DNA解链效率，提高脱靶活性。
• 正超螺旋对Cas9介导的解链影响较小，而负超螺旋的解链速率约为松弛DNA的两倍。
• MutS对错配碱基的结合在负超螺旋和正超螺旋状态下均增强，但超螺旋状态不影响ATP诱导的滑动夹形成速率。

研究意义与展望
本研究提供了一种高效的位点特异性DNA标记及超螺旋调控方法，为研究DNA结构动态对蛋白质结合的影响提供了通用平台。未来可用于研究其他DNA结合蛋白在超螺旋环境中的行为，拓展对基因组稳定性及调控的认知。

 

构建高纯度基因治疗AAV载体，支持多种血清型包装及体内基因表达调控研究。

了解更多

 

结语
该研究展示了一种适用于高通量单分子分析的质粒DNA制备方法，结合smTIRF显微镜技术，使DNA超螺旋对蛋白质结合影响的实时观测成为可能。负超螺旋促进Cas9在错配位点的DNA解链，而正负超螺旋均增强MutS对错配的识别，但不改变其构象转变动力学。这些结果表明，DNA拓扑结构在调控基因组功能中具有重要作用。研究不仅优化了单分子FRET实验系统，也为CRISPR–Cas9脱靶机制及DNA错配修复研究提供了新工具。该方法的通用性使其适用于多种蛋白质–DNA相互作用研究，有助于揭示DNA超螺旋在基因调控、DNA修复及复制中的动态机制。

 

Huijin Lee, Fahad Rashid, Jihee Hwang, Sua Myong, and Taekjip Ha. A high-throughput single-molecule platform to study DNA supercoiling effect on protein–DNA interactions. Nucleic Acids Research.