Nature（IF=48.5）：改写教科书！中性粒细胞可强化皮肤屏障

在这项研究中，研究人员构建了多种小鼠模型，包括中性粒细胞特异性的基因敲除模型Tgfbr^ΔN、Col3a1^ΔN（使用了赛业生物提供的Col3a1-floxed小鼠构建）、中性粒细胞减少症模型，以及CNA35–mCherry报告基因小鼠模型（由赛业生物提供），用于追踪胶原沉积。他们采用共聚焦显微镜、扫描电镜和透射电镜来观察中性粒细胞分布、基质蛋白表达及胶原纤维结构，还开展皮肤力学拉伸实验、Evans Blue渗透实验、细菌入侵实验，评估基质对皮肤屏障功能的影响。

研究人员首先对六种健康组织的转录组数据集进行分析，发现与非屏障组织相比，来自屏障组织（肺、结肠和皮肤）的中性粒细胞表现出与细胞外基质（ECM）相关的特征，编码I型和III型胶原蛋白以及纤连蛋白的基因（Col1a1、Col3a1和Fn1）在表达上显著上调。为了验证这一点，他们从这些组织中提取出中性粒细胞并进行COL3A1染色。与预期一致，COL3A1⁺细胞在屏障器官中丰度更高，其中皮肤中高达75%的中性粒细胞呈阳性。这些结果表明，在稳态条件下定植于皮肤及其他屏障组织的中性粒细胞会产生基质蛋白。

利用两种互补的中性粒细胞减少症小鼠模型（组成型Mcl1^ΔN和诱导型iDTR），研究人员发现胶原蛋白异构体的相对丰度在中性粒细胞减少后发生了显著变化。扫描电镜（SEM）分析显示，iDTR小鼠皮肤中胶原纤维的厚度和密度明显减少（图1）。此外，中性粒细胞减少导致小鼠皮肤的拉伸刚度显著降低，但在肺和肠道中未观察到此现象。这些结果表明中性粒细胞控制着皮肤基质稳态的动态变化，其耗竭会改变皮肤组成、纤维结构和力学性质。值得注意的是，仅敲除中性粒细胞中的Col3a1基因的Col3a1^ΔN小鼠（使用了赛业生物提供的Col3a1-floxed小鼠构建）并未改变皮肤刚度和通透性。

考虑到中性粒细胞是以昼夜节律的方式浸润到大部分组织中，他们还评估了基质相关蛋白的表达模式。他们发现，编码胶原蛋白异构体或蛋白质的几个基因表现出昼夜节律表达模式，而且这些基因的昼夜节律模式与中性粒细胞的浸润时间一致。在去除小鼠的中性粒细胞后，皮肤中大多数基质基因的昼夜节律模式发生了巨大变化（图1）。这些结果表明中性粒细胞控制了昼夜节律的基质转录。

图1 中性粒细胞控制皮肤的基质组成、结构和力学性质^[1]

接下来，研究人员采用基于qPCR的体内筛选策略，以寻找中性粒细胞基质程序的驱动因素。由于皮肤中的中性粒细胞数量较少，他们首先利用肺部中性粒细胞进行初筛，随后在皮肤中进行验证。利用突变小鼠或抑制剂处理小鼠进行体内筛选后，他们鉴定出三条影响基质基因表达的通路，其中一条是TGFβ信号通路。

染色质可及性分析显示，在肺部中性粒细胞的开放染色质位点中，很大一部分（44.6%）集中在SMAD2和SMAD3转录因子识别的基序中，这些转录因子控制了TGFβ诱导基因的表达（图2）。与此一致，部分肺部中性粒细胞的磷酸化SMAD3的染色结果呈阳性。因此，他们假设基质特征的获得是由TGFβ信号通路驱动的。

为了验证这一可能性，研究人员构建了一种中性粒细胞特异性的TGFβ信号缺陷（Tgfbr^ΔN）小鼠。单细胞分析和批量细胞RNA测序结果均显示，Tgfbr^ΔN中性粒细胞中的基质相关基因表达和ECM相关程序下降，表明细胞内在的TGFβ信号传导驱动中性粒细胞产生基质蛋白。后续分析显示，抑制中性粒细胞中的TGFβ信号传导会导致小鼠皮肤中的胶原纤维排列混乱（图2）且纤维直径减小，并伴随着皮肤刚度的降低。这表明中性粒细胞通过TGFβ进行的组织特异性编程支持了皮肤的结构和力学性质。

图2 TGFβ信号传导驱动屏障中性粒细胞的基质程序^[1]

为了评估中性粒细胞的这些功能在屏障受损时是否同样重要，研究人员使用了局部微小伤口模型。在伤口愈合的早期阶段，他们观察到COL3A1⁺中性粒细胞包围了扩大的伤口。在招募中性粒细胞的同时，伤口周围形成了一个富含基质的环状结构（直径达1 mm），呈COL3A1阳性，且在愈合的晚期阶段持续存在（图3）。在中性粒细胞减少症或TGFβ信号缺陷的小鼠中，这种环状结构的形成受损。

中性粒细胞来源的基质成分存在于伤口周围，提示中性粒细胞可能构建物理屏障，防止有害分子或微生物进入无菌组织。为了验证这一假设，研究人员将第3天的伤口表明暴露于Evans Blue染料。他们发现，中性粒细胞减少症或Tgfbr^ΔN小鼠的染料扩散增加，表明伤口周围的组织结构更具渗透性。当伤口暴露于金黄色葡萄球菌时，Tgfbr^ΔN小鼠伤口中的细菌扩散范围更广，渗透程度更深（图3）。因此，中性粒细胞通过产生基质蛋白而形成屏障，在皮肤屏障受损时可防止小分子和微生物入侵。

图3 中性粒细胞通过形成基质环状结构来保护皮肤伤口^[1]