Nature（IF=48.5）：韩硕/高强团队基于邻近标记开发抗原扩增技术，为肿瘤治疗提供新思路

在这项研究中，研究人员合成了平均直径为40 nm的PCN纳米酶，并系统地评估PCN纳米酶在细胞表面实现邻近标记。他们之后设计了人工抗原FITC探针以及特异性BiTE，以评估局部抗原扩增是否能促进T细胞活化和肿瘤细胞清除。之后，他们建立了患者来源的肿瘤类器官模型和多个小鼠肿瘤模型（其中免疫系统人源化小鼠模型huPBMC-C-NKG小鼠由赛业生物提供），并在PATCH处理后观察肿瘤生长和小鼠存活情况。

研究人员设想，由红光或超声激活的纳米酶较传统催化方法具有明显优势，因为红光和超声波均能穿透深层组织以满足体内应用需求。为此，他们合成了平均直径为40 nm的PCN纳米酶（图1）。在体外实验中，PCN纳米酶在红光或超声刺激下，可通过产生活性中间体高效地对牛血清白蛋白（BSA）进行生物素化标记，而加入淬灭剂能有效抑制标记反应。由此可见，PCN纳米酶在红光或超声激活下能够在体外实现广泛的蛋白质标记。

图1 基于邻近标记技术扩增抗原的示意图^[1]

之后，研究人员探究了是否能够利用PCN纳米酶实现细胞表面邻近标记。他们选择了三种有代表性的肿瘤相关抗原，分别是HER2、FOLR（叶酸受体）和CD44v6（CD44剪接变体），随后通过化学偶联将PCN纳米酶与相应受体的配体偶联，构建了HER2-PCN、FA-PCN和HA-PCN，并在小鼠乳腺癌细胞、肺癌细胞和结肠癌细胞中开展了活细胞邻近标记实验。

在红光或超声激活下，这些工程化PCN纳米酶能特异性地结合到表达相应抗原的细胞表面，实现细胞表面蛋白质的邻近标记。对生物素化蛋白进行LC-MS/MS分析后，基因本体分析显示标记的蛋白质主要集中在细胞表面蛋白和质膜相关蛋白，且标记具有邻近依赖性。这些结果表明，工程化PCN纳米酶能高效催化生物素探针在目标细胞表面进行空间受限的标记反应。

接下来，研究人员评估了局部抗原扩增（即PATCH策略）在受体聚集中的应用潜力。他们为PATCH设计了FITC探针，因为FITC本身毒性极低，但与蛋白（如半抗原）共价结合时会产生强的免疫原性（图2）。荧光成像显示，设计的FITC探针在PCN纳米酶催化下，能够在目标细胞表面实现高效的FITC标记，其荧光强度比非共价结合配体或抗体-FITC高10-30倍，这凸显了催化扩增的有效性（图2）。

以TCR作为模型受体，他们推测这种局部抗原扩增可通过驱动TCR聚集和T细胞活化实现高效的肿瘤细胞清除。他们成功构建了FITC特异性BiTE，这种衔接器可以同时结合FITC和T细胞表面CD3分子。在加入FITC-BiTE后，小鼠脾脏T细胞显著增强了对PATCH标记的4T1细胞的杀伤作用。而且，经PATCH处理的样本中TNF-a和IFN-γ的分泌水平较对照组显著升高（图2）。在机制上，PATCH通过驱动TCR聚集激活下游信号通路，具体表现为LCK（Tyr394）和LAT（Tyr191）磷酸化水平显著升高。

图2 PATCH刺激TCR活化^[1]

在复杂的组织微环境中，多种抑制机制协同作用，抑制受体聚集和活化及下游信号传导。为了探究PATCH是否能克服这些抑制机制，研究人员采用患者来源的肿瘤类器官模型进行验证。在三种HER2+肿瘤类器官中，PATCH处理后约50%-90%的肿瘤细胞被清除。在大多数HER2+患者来源的肿瘤片段（7/8）中，PATCH显著促进了T细胞活化。这些结果表明，PATCH在肿瘤微环境中诱导T细胞活化的效果显著且具有广泛适用性。

之后，研究人员进一步分析了PATCH在多个免疫功能正常的小鼠肿瘤模型中的作用。在小鼠4T1乳腺癌模型中，仅经过两轮PATCH处理和BiTE给药，小鼠肿瘤完全消退，且未出现毒性或炎症迹象（图3）。

在M109肺癌模型中，单轮PATCH处理后10天，小鼠的肿瘤体积迅速缩小。而在CT26结直肠癌模型中，红光或超声激活的PATCH均显示出肿瘤体积缩小并延长小鼠生存期。此外，在免疫系统人源化小鼠模型（huPBMC-C-NKG小鼠由赛业生物提供）中，PATCH处理后肿瘤迅速缩小。

图3 PATCH诱导小鼠实体瘤模型中的T细胞活化和肿瘤清除^[1]

考虑到PATCH介导的T细胞活化和细胞毒性作用效果显著，研究人员推测抗原呈递细胞会摄取肿瘤抗原，进而促进全身性免疫反应。为了验证这一点，他们构建了双侧4T1肿瘤模型，并对“原发性”肿瘤进行PATCH处理，而未处理的“继发性”肿瘤作为对照。值得注意的是，PATCH处理不仅能清除原发性肿瘤，还能显著延缓继发性肿瘤进展，表明全身性抗肿瘤反应已被激活。在肿瘤再挑战实验中，之前经PATCH治愈的小鼠再次接种肿瘤细胞后呈现完全排斥反应。这些数据表明，局部PATCH诱导的抗肿瘤反应不仅能对局部免疫微环境进行重编程，还能引发全身性免疫攻击，并建立内源性免疫记忆。