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CAR-T细胞治疗的研究现状
2023-03-22

CAR-T细胞治疗的研究现状

 

嵌合抗原受体(CAR)是经过工程改造的合成受体,能重定向淋巴细胞(最常见的是T细胞),以识别和消除表达特定靶抗原的细胞。CAR与细胞表面表达的靶抗原的结合独立于MHC受体,会导致剧烈的T细胞活化和强大的抗肿瘤反应。现如今,CAR-T细胞在治疗B细胞白血病或淋巴瘤的某些亚群以及多发性骨髓瘤中产生了显著的临床反应,但同时存在多方面的局限性使其难以进一步发挥疗效,如严重的毒副作用、抗原逃逸、有限的肿瘤浸润、肿瘤微环境的抑制等。

 

为了更好地梳理CAR-T细胞治疗的研究现状,我们将从3个方面展开论述:

1. 介绍CAR结构及其设计原则

2. 盘点CAR-T细胞治疗的局限性及潜在风险

3. 如何打破困局、提升治疗效果的创新策略

 

CAR结构及其设计原则

 

CAR是模块化合成受体,由4个主要部分组成:细胞外靶抗原结合结构域、铰链区域、跨膜结构域、一个或多个细胞内信号结构域。

 

1. 抗原结合域

抗原结合结构域是CAR中赋予靶抗原特异性的部分,通常来源于抗体的重链可变区(Viarable Heavy chain, VH)和轻链可变区(Viarablelight chain, VL),通过柔性接头连接形成单链可变片段(Singlechain fragment variable, scFv)。该部分可以直接识别肿瘤细胞表面抗原,进而导致MHC非依赖性T细胞活化。

 

scFv不仅是识别和结合目标表位,还有几个重要特征会影响CAR的功能。例如,VH链和VL链之间的交互模式以及互补决定区域的相对位置均会影响CAR对其靶表位的亲和力和特异性。为了识别肿瘤细胞上的抗原,诱导CAR信号传导并激活T细胞,CARs抗原结合亲和力必须足够高,但不能高到导致表达CAR的细胞的活化诱导死亡并触发毒性。为了优化CAR与其靶抗原的结合,必须考虑其他因素,如表位位置、靶抗原密度,且避免与配体非依赖性强直信号传导等。

 

2. 铰链区域

铰链或间隔区被定义为从跨膜结构域延伸到结合单元(scFv)的细胞外结构区。铰链能提供克服空间位阻的灵活性,以允许抗原结合结构域进入靶向表位。其长度和组成差异会由多方面影响CAR-T细胞的功能,包括:结合的灵活性、CAR分子表达、信号传导、表位识别、激活输出强度和表位识别等。除此之外,有研究指出间隔长度对于提供足够的细胞间距离以允许免疫突触形成也至关重要。

 

最常用的铰链区域通常来源于CD8、CD28、IgG1或IgG4的氨基酸序列。其中,IgG衍生的间隔物可导致CAR-T细胞耗竭,从而降低体内持久性,因为它们可以与Fcγ受体相互作用。目前一些研究试图通过对IgG Fc受体结合部位进行突变来克服其这一缺陷。

 

3. 跨膜结构域

跨膜结构域的主要功能是将CAR锚定在T细胞膜上,但也有证据表明,它可能与CAR-T细胞功能相关。CAR跨膜结构域可以影响CAR表达水平、稳定性,在信号传导或突触形成中发挥作用,并与内源性信号分子二聚化相关。

 

大多数跨膜结构域来源于天然蛋白质,包括CD3ζ、CD4、CD8α或CD28等。由于CD3ζ跨膜结构域介导CAR二聚化并掺入内源性TCR,CD3ζ跨膜区可能促使了T细胞活化,但同时也降低了CAR稳定性。另外,因为跨膜结构域和铰链区域会影响CAR-T细胞因子的产生和活化诱导的细胞死亡(activation induced cell death, AICD),相比于CD28,具有CD8α跨膜和铰链结构域的CAR-T细胞释放的TNF和IFN-γ量减少,其对AICD的敏感性降低。

 

总的来说,通过将近端细胞内结构域连接到相应的跨膜结构域,可以促进适当的CAR-T细胞信号传导;通过使用CD8α或CD28跨膜结构域,可以增强CAR表达和稳定性。

 

4. 胞内信号传导结构域

在CAR分子结构中最受关注的原件应该是CAR共刺激结构域。

 

1990年代后期设计的第一代CAR包含CD3ζ或FcRγ信号结构域,但由于其体外耐用性和持久性并不理想,在临床上也仅显示有限疗效或没有疗效。

 

基于共刺激结构域对持久治疗具有重要作用的理解,产生了具有一个共刺激结构域的第二代CAR,其在结构上与CD3ζ细胞内信号结构域串联。目前,FDA批准的CAR-T治疗产品中两个最常见的共刺激域CD28和4-1BB(CD137)都与高患者反应率有关。临床上,第二代CAR-T细胞在慢性淋巴细胞白血病、B细胞急性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤等多种血液系统恶性肿瘤中产生了较强的治疗反应;关于实体瘤主要应用于胶质母细胞瘤、晚期肉瘤、肝转移瘤、卵巢癌等;此外还存在几种替代的共刺激结构域。

 

据推测,仅通过一个结构域的共刺激会产生不完全激活。因此第三代CAR应运而生,其包含两个与CD3ζ串联的共刺激结构域,但其临床前研究产生了不同甚至相互矛盾的结果,在应用转化方面仍存在较多掣肘。

 

盘点CAR-T细胞治疗的局限性及潜在风险

 

历经多年发展,嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法已成为癌症治疗的革命性方法,其中,CD19靶点药物在治疗B细胞恶性肿瘤方面更是取得了前所未有的成功,并于2017年获得美国FDA批准。CAR分子是影响CAR-T细胞治疗有效性的关键,认识其组成结构,对临床前研究有着重要作用,但CAR-T细胞疗法未能在当前肿瘤治疗中大行其道,还是因为诸多局限性的存在给人们带来顾虑。如临床案例中可观察到的抗原逃逸现象,又比如难以避免的CAR-T细胞相关毒性(CRS和神经毒性等),同时,在实体瘤中,让CAR-T细胞运输到肿瘤并浸润也是一个挑战,其肿瘤免疫抑制微环境中的物理特性、抑制性细胞和抑制性因子进一步加大了技术攻关难度。

 

1. 抗原逃逸

CAR-T细胞疗法最具挑战的技术要点之一是肿瘤对靶向单一抗原CAR-T细胞的耐药性。虽然最初靶向CAR-T细胞的单一抗原可以提供高反应率,但患者的部分恶性细胞显示出部分或完全失去靶抗原表达,这种现象被称为抗原逃逸。

 

例如,通过CD19靶向CAR-T细胞来治疗复发/难治性急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)的患者中,有70-90%表现出持久的反应,但最近的随访数据表明存在一种常见的疾病耐药机制,19-30%的治疗后复发性疾病患者出现CD19抗原下调/丢失逃逸的情况。同样,在接受BCMA靶向CAR-T细胞治疗的多发性骨髓瘤患者中,也观察到治疗后患者BCMA表达下调或丧失。

 

此外,在实体瘤中也观察到类似的抗原逃逸抗性模式。例如,在胶质母细胞瘤中靶向IL13Ra2的CAR-T细胞治疗病例报告表明,肿瘤复发显示IL13Ra2表达降低。

 

2. On-Target Off-Tumor效应

靶向实体瘤抗原的挑战之一是:实体瘤抗原通常也在正常组织中以不同水平表达,以及在肿瘤组织表达存在异质性。因此,抗原选择在CAR设计中至关重要,不仅可以确保治疗效果,还可以限制脱靶毒性。为了扩大CAR-T细胞疗法在血液恶性肿瘤和实体瘤中的临床应用,有必要进一步开发创新策略以减少抗原逃逸,并选择能够诱导足够抗肿瘤功效的抗原,同时最大限度减少毒性问题。

 

3. CAR-T细胞运输和肿瘤浸润

与血液恶性肿瘤相比,实体瘤的治疗受到CAR-T细胞运输和浸润实体瘤能力不足的限制,因为免疫抑制肿瘤微环境和物理肿瘤屏障(如肿瘤基质)限制了CAR-T细胞的渗透和移动性,其中,基质主要由细胞外基质组成,硫酸肝素蛋白聚糖(Heparan sulfate proteoglycan, HSPG)是CAR-T细胞必须降解才能进入肿瘤的主要成分。

 

4. 免疫抑制微环境

在肿瘤微环境中,许多驱动免疫抑制的细胞类型可以浸润实体瘤,肿瘤细胞表面上调的PDL1也可通过激活PD-1免疫检查点途径可降低免疫细胞的抗肿瘤活力。因此,CAR-T细胞和检查点阻断相结合的联合免疫疗法被认为是下一个免疫疗法前沿,因为它提供了强免疫反应所需的两个要素:CAR-T细胞浸润和PD-1/PD-L1阻断,可保证T细胞的功能持久性。

 

尽管这样一种新的免疫疗法出现,但要认识到,这种组合可能仍不足以诱导T细胞浸润和效应功能。因此,需要将CAR-T细胞疗法和检查点阻断与其他免疫疗法/策略相结合,以便在复杂的血液系统恶性肿瘤或实体瘤中发挥T细胞浸润和效应功能。

 

5. CAR-T细胞相关毒性

高毒性率和部分死亡案例使CAR-T细胞疗法无法成为一线治疗,迄今为止,CAR-T细胞疗法的毒性在接受首个FDA批准的CAR-T细胞疗法CD19靶向CAR的患者中得到了广泛研究。在接受治疗的急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤患者中,几乎都至少存在一些不太严重的毒性表现,23-46%的患者有严重的超生理细胞因子产生和大量的体内T细胞扩增。

 

细胞因子释放综合征(Cytokine release syndrome, CRS)以及免疫效应细胞相关神经毒性综合征(Immune Effector Cell-Associated neurotoxicity syndrome, ICANS)是需要引起临床关注的2种CAR-T疗法毒性,可能决定其发病率和严重程度的关键因素是CAR的设计、特定靶点和肿瘤类型。

 

从机制上讲,CRS发生的主要原因是CAR-T细胞广泛激活导致了大量细胞因子的释放。病理生理学上,CRS被认为主要由IL-6介导,因此,治疗依赖于使用托珠单抗和皮质类固醇阻断IL-6受体,但即便如此,严重的CRS和死亡仍然会发生。

 

对于神经毒性,其潜在的病理生理学和机制尚不完全清楚,IL-6抑制剂通常对CAR-T细胞治疗相关的神经毒性无效。迄今为止,尚无预防上述毒性的疗法获批,因此必须优化CAR工程并采用其他策略来降低CAR诱导的毒性。

 

如何打破困局、提升治疗效果的创新策略

 

1. 工程化CAR-T细胞

为了获得有效的治疗反应,CAR-T细胞抗原结合结构域必须结合其靶表位并达到诱导CAR-T细胞活化和细胞因子分泌的最低阈值水平,但也不能超过最高阈值时,否则会产生毒性水平的细胞因子和免疫系统激活。CAR-T细胞活化和活化动力学的程度受多种因素的影响,包括但不限于肿瘤细胞上抗原表达水平、肿瘤负荷、抗原结合结构域与其靶表位的亲和力以及CAR的共刺激结构域。因此,有必要优化CAR模块化结构,以改善治疗效果和限制毒性。

 

2. 改变CAR分子结构

降低CAR-T细胞抗原结合域的亲和力是降低毒性的一种重要途径,这将导致对肿瘤细胞上更高抗原密度的需求增加,以实现高水平的活化,能规避对抗原含量相对较低的健康组织的影响。通过修饰铰链和跨膜区来改变活化的CAR-T细胞调节细胞因子分泌,也可以达到降低毒性的目的。

 

另外,共刺激结构域在CAR设计中提供了另一个可修饰的结构区域,可以根据肿瘤类型、肿瘤负荷、抗原密度、靶抗原-抗原结合结构域进行定制。具体而言,含有4-1BB结构域的CAR-细胞具有较低的毒性风险、较高的T细胞耐力和较低的T细胞扩增峰值水平,而含有CD28的则体现为活化速度更快、强度更高,但其衰竭速度也更快,持久性不足。

 

3. CAR免疫原性

在细胞因子相关毒性的产生中,宿主免疫系统对CAR的识别可能有重要作用,因此,可以利用人或人源化抗体片段而不是鼠源性抗体片段来降低CAR免疫原性。此外,也可以通过优化铰链/跨膜结构域以降低CAR的免疫原性,并且有趣的是,CAR-T细胞持久性也可能得到改善。

 

4. 给CAR-T细胞装上开关

改善CAR-T细胞毒性的另一个潜在途径是通过实施“关闭开关”或自杀基因策略。这将有助于通过二级诱导剂,在不良事件发生时选择性降低CAR-T细胞的功能。基于该理念,目前已经开发了可以调控CAR-T细胞功能的方法,如诱导型Casp9,在一项临床试验中,它在30分钟内消除了超90%的CAR-T细胞。

 

自杀策略或其他类似方法的最大限制是,它们的使用会突然停止对快速进展的疾病的治疗。一种具有潜力的解决方法是使用达沙替尼(一种酪氨酸激酶抑制剂),其功能是通过抑制近端TCR信号激酶来抑制T细胞的活化。在临床前模型中,达沙替尼能快速且可逆地阻止CAR-T细胞的活化,并且在CAR-T细胞输注后,早期给予达沙替尼可显著降低其他致命CRS小鼠的死亡率。这种方法可暂时抑制了CAR-T细胞功能,并且在毒性消退后挽救CAR-T细胞疗法。

 

CAR-T细胞治疗展望

 

尽管当前CAR-T细胞治疗在毒副作用、耐药性等方面存在诸多挑战,药物安全性面临考验,但随着CAR分子设计的不断优化,以及联合疗法开发,相信CAR-T细胞治疗的应用会到达一个更为高效安全的水平。

 

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