Lcat-KO 基因敲除小鼠

Lcat，全称为lecithin:cholesterol acyltransferase（卵磷脂：胆固醇酰基转移酶），是一种关键的酶，参与将胆固醇从周围组织运输回肝脏的反向胆固醇转运过程。LCAT缺乏症是一种遗传性疾病，其中这种酶先天缺失，导致血浆中游离胆固醇的酯化受损，从而导致磷脂（包括卵磷脂）在体内器官中积累；临床表现为角膜混浊、正色素性贫血、肾脏疾病等。预后由肾功能不全的程度决定，肾活检标本显示特征性的光和电子显微镜发现。该疾病通过常染色体隐性遗传方式传递，非常罕见。全世界仅报告了88种LCAT基因突变，其中13种来自日本。LCAT缺乏症的一个特点是这些基因突变的模式、程度和表型之间的强相关性[1]。

雌激素对HCC的发展有保护作用。对小鼠和人类肝脏癌症的转录组分析表明，LCAT是最受雌激素上调的基因，也是良好预后的生物标志物。LCAT上调抑制了体外和体内的HCC，并通过ESR1依赖性方式介导了雌激素诱导的HCC抑制。LCAT通过LDLR和SCARB1途径促进高密度脂蛋白胆固醇的产生和摄取。一致地，高HDL-C水平与HCC患者良好的预后相对应。LCAT诱导的HDL-C吸收损害了SREBP2的成熟，最终抑制了胆固醇的生物合成，并抑制了HCC细胞的增殖。HDL-C单独抑制了HCC的生长，与降胆固醇药物洛伐他汀相当，而SREBF2过表达消除了LCAT的抑制作用。临床观察和多数据库的交叉分析证实，LCAT和HDL-C水平升高与胆固醇合成减少和HCC患者预后改善相关。此外，LCAT缺乏症模拟了卵巢切除对携带HCC的女鼠的肿瘤生长促进作用，而LCAT过表达消除了这种促进作用。最重要的是，HDL-C和LCAT延缓了裸鼠皮下肿瘤的发生，并且HDL-C与仑伐替尼协同作用，消除了原位肝肿瘤。总之，这项研究表明，雌激素通过激活LCAT/HDL-C轴来维持胆固醇稳态并抑制肝细胞癌的发生。LCAT和HDL-C代表胆固醇稳态作为治疗HCC的策略的潜在预后和治疗生物标志物[2]。

在克罗地亚报告了首例家族性LCAT缺乏症的病例，具有经典的临床和生化特征。一位患有肾病综合征、角膜混浊、肝脾肿大、贫血、低高密度脂蛋白（HDL）胆固醇水平和高血压（血压>200/100 mmHg）的30岁男性被送入我们的部门。入院时，他血清肌酐水平升高（233 μmol/L），24小时尿蛋白为12 g（g/24 h），尿沉渣中有3-7个红细胞，显著的贫血（血红蛋白水平90 g/l）。他的HDL-胆固醇显著低（0.42 mmol/L）。除了慢性肾脏病（CKD）外，还排除了其他继发性高血压的原因。该患者先前被诊断为膜性肾病，并接受免疫抑制剂（类固醇、环孢素、环磷酰胺）治疗无效。重新评估肾活检的组织病理学结果发现，肾小球基底膜和系膜区域有大量脂质物质沉积。他的4岁弟弟也因角膜混浊和突发性高血压而接受评估。确定了肾病范围的蛋白尿，并保留了全球肾功能。他也有非常低的HDL-胆固醇水平。两名患者的肾活检与LCAT缺乏症一致。通过测量LCAT酶活性、血浆胆固醇酯化率和基因检测证实了该疾病。在LCAT基因中发现两种新的错义变异（c.496G > A和c.1138T > C）。据我们所知，这些病例是克罗地亚首次报道的遗传性LCAT缺乏症病例。鉴于临床表现、LCAT活性的完全缺乏和胆固醇酯化率的降低，诊断为家族性LCAT缺乏症[3]。

尽管迫切需要终身治疗遗传病，但由于这些疾病很少见，因此很少有努力开发针对大多数这些疾病的治疗方法。家族性卵磷脂：胆固醇酰基转移酶（LCAT）缺乏症被认为是一种这样的孤儿病。我们一直在开发一种基于脂肪细胞的体外基因治疗/再生医学，这是一种与腺相关病毒介导的体内基因治疗或体外基因转导的造血细胞治疗不同的新型方法，以治疗家族性LCAT缺乏症。最近，在《再生医学安全法》下进行了一项首次人体（FIH）临床试验，其中一名家族性LCAT缺乏症患者接受了治疗。为了获得将该治疗方法投入实际使用的批准，设计了一项参照FIH临床试验的临床试验。计划进行一项干预性、开放标签、非盲法的剂量递增试验，参照先前的FIH临床试验。该试验旨在使用两种剂量评估试验产品的安全性，并探索性地评估治疗的有效性。将连续入组三名患者，并在给药后随访24周。这项研究被设计为多中心试验，千叶大学医院在规定的访问时管理和评估试验产品的安全性/有效性。这项临床试验有望为许多LCAT缺乏症患者提供终身治疗[4]。

LCAT是一种脂质修饰酶，它催化卵磷脂和胆固醇之间的酰基链转移，形成胆固醇酯和溶血卵磷脂。家族性LCAT缺乏症是一种由LCAT酶遗传性功能障碍引起的难治性常染色体隐性障碍。根据基因突变的位置，该疾病表现为两种不同的表型：家族性LCAT缺乏症（FLD，OMIM 245900），其HDL和ApoB含有的脂蛋白的酯化活性缺失，以及鱼眼病（FED，OMIM 136120），其仅HDL缺乏活性。由于LCAT功能障碍导致胆固醇和磷脂代谢受损，导致血浆脂蛋白的异常浓度、组成和形态，以及某些组织/细胞中的异位脂质积累或异常脂质组成，以及某些器官的严重功能障碍和并发症。血浆HDL-胆固醇（HDL-C）的显著降低和角膜混浊是FLD和FED的常见临床表现。FLD还伴有贫血、蛋白尿和进行性肾衰竭，最终需要血液透析。LCAT酶的替代治疗应防止严重并发症的进展，特别是肾功能不全和角膜混浊。目前正在开展一项旨在进行基因/细胞治疗的研究[5]。

LCAT是血浆中唯一能够酯化胆固醇并增强胆固醇酯化的酶，其与磷脂衍生的酰基链相关。为了更好地理解LCAT研究进展，不可避免地将其与高密度脂蛋白（HDL）代谢和反向胆固醇转运（RCT）联系起来。由于LCAT在HDL代谢和RCT中发挥着核心作用，因此许多动物研究和临床研究目前旨在通过提高LCAT活性来改善血浆脂质代谢，以找到更好的治疗选择，用于家族性LCAT缺乏症（FLD）、鱼眼病（FED）和心血管疾病。重组人LCAT（rhLCAT）注射、细胞和基因治疗以及小分子激活剂已经进行，并取得了有希望的结果。最近，rhLCAT疗法已进入临床II期试验，前景良好。在这篇综述中，我们讨论了与LCAT相关的疾病和以LCAT为靶点的治疗方法，希望找出LCAT是否可以成为治疗冠心病和动脉粥样硬化的有效治疗靶点。此外，探索LCAT的作用机制可能有助于更好地理解HDL的异质性以及动态脂蛋白颗粒的作用机制[6]。

胆固醇的循环运输及其从组织中的清除取决于卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）的活性。LCAT是一种可溶性酶，它将胆固醇和卵磷脂（卵磷脂）转化为胆固醇酯和溶血磷脂酰胆碱，在高密度脂蛋白的表面。本综述介绍了关于人类LCAT的结构、反应和底物以及LCAT基因表达的背景信息和最新研究进展。虽然LCAT的三维结构尚未知晓，但目前已存在一个部分模型，有助于研究天然和工程突变体的结构-功能关系。LCAT在脂蛋白上的反应包括几个步骤，从酶与脂蛋白/脂质表面的结合开始，然后是LCAT被载脂蛋白激活，结合脂质底物和催化步骤产生脂质产物。定量数据展示了LCAT反应步骤的一些动力学和平衡常数。最后，在鼠和兔中过表达人类LCAT基因已被用于研究LCAT在体内的生理作用及其对饮食诱导的动脉粥样硬化的保护作用[7]。

遗传性LCAT缺乏症是一种罕见的代谢障碍，其特征是血浆HDL胆固醇水平低。该疾病的临床表现包括角膜混浊、贫血和肾脏疾病，这是携带者发病和死亡的主要原因。该疾病的生化临床表现和临床表现在携带者中非常异质。需要收集大量受影响个体的系列数据，以回答关于这种罕见脂质代谢障碍的各种开放性问题，例如完全性LCAT缺乏症患者肾损害的原因以及不同LCAT基因突变携带者的心血管风险。家族性LCAT缺乏症是一种罕见的疾病，具有严重的临床表现，可能发生在生命的第一个十年，目前尚无治愈方法。携带者及时诊断以及识别能够预测临床表现的疾病生物标志物，将对识别携带者以接受未来可用的治疗方法非常有帮助[8]。

为了研究LCAT作为基因治疗的潜在用途，构建了一个重组腺病毒，其中人LCAT cDNA在人类巨细胞病毒立即/早期启动子的控制下表达，随后是嵌合内含子（AdCMV人LCAT）。感染AdCMV人LCAT的载脂蛋白A-I转基因小鼠通过静脉注射在血浆中积累了反应性LCAT。与对照小鼠中测量的基础LCAT活性相比，感染1 x 10(6) pfu AdCMV人LCAT的小鼠血浆中的LCAT活性增加了201倍，从45 +/- 2增加到9068 +/- 812 nmol.mL-1.h-1，注射后5天。与对照小鼠相比，感染AdCMV人LCAT小鼠的血浆HDL胆固醇水平从117 +/- 12上升到797 +/- 48 mg/dL，血浆人载脂蛋白A-I浓度从247 +/- 14上升到616 +/- 17 mg/dL。HDL颗粒更大，具有不同的电泳迁移率。通过将血清与胆固醇负载的Fu5AH细胞共培养来研究胆固醇流出，发现AdCMV人LCAT感染小鼠的血清比对照组的血清促进了显著更高的流出。这些数据确立了这种方法治疗LCAT基因缺陷患者以及低血浆载脂蛋白A-I和HDL胆固醇水平的患者的潜力[9]。

家族性卵磷脂-胆固醇酰基转移酶缺乏症（FLD）是一种罕见的隐性胆固醇代谢障碍，由人类LCAT基因的功能缺失突变引起，导致脂质/脂蛋白谱改变，HDL水平极低。经典的FLD表型以弥漫性角膜混浊、溶血性贫血和蛋白尿性慢性肾脏病（CKD）为特征；据报道，一些家族中仅影响角膜的不完全形式。我们描述了LCAT缺乏症的中间表型，其中CKD先于角膜混浊的发展，在两名葡萄牙兄弟中发现了新的错义LCAT基因突变。这种非典型表型、先证者原位肾活检中膜性肾病的诊断、角膜混浊的晚发和延迟识别、与吉尔伯特综合征的共分离以及原位肾脏移植后原位疾病的晚期复发，在许多年内掩盖了LCAT缺乏症综合征的诊断。一个重要的教学要点是，在LCAT缺乏症患者中，在标准的光学显微镜检查中，肾活检可能不会显示显著的空泡化，可能被误诊为膜性肾病。这两名患者的病例还说明了在出现蛋白尿性CKD的年轻成人中进行详细体检的重要性，因为FLD诊断的最重要线索在眼睛中[10]。

综上所述，LCAT是一种关键的酶，参与胆固醇的代谢和转运，其缺乏症是一种罕见的遗传性疾病，具有多种临床表现。LCAT的研究进展表明，其不仅与胆固醇代谢和心血管疾病有关，还可能与癌症的发生和预后相关。LCAT作为一种潜在的基因治疗靶点，有望为LCAT缺乏症和其他相关疾病的治疗提供新的思路和策略。