Myocd-KO 基因敲除小鼠

Myocd，也称为Myocardin，是一种重要的转录共激活因子。Myocardin主要在心肌和平滑肌细胞中发挥作用，通过与血清反应因子（SRF）相互作用，激活一系列编码收缩、离子通道、细胞骨架和钙处理蛋白的基因。Myocardin的发现已有十多年的历史，对其在细胞中的各种异构体表达、以及通过转录、转录后和翻译后过程对Myocardin表达和活性的调节等方面有了新的认识。值得注意的是，Myocardin还具有一些独立于收缩基因表达和CArG-SRF核蛋白复合物的功能。此外，Myocardin基因表达的异常与越来越多的疾病有关，包括心力衰竭、癌症、急性血管疾病和糖尿病[2]。

研究发现，Myocardin在心血管细胞谱系特化过程中起着关键作用。Myocardin通过浓度依赖性和开关样形成转录凝结体来激活细胞身份基因。Myocardin在平滑肌细胞和心肌细胞分化过程中形成这样的凝结体，并在达到关键浓度阈值时激活细胞身份基因。Myocardin的羧基末端无序区域对于凝结体形成是必要和充分的。破坏该区域形成凝结体的能力会破坏基因激活和平滑肌细胞重新编程。通过用来自功能无关蛋白的无序区域替换该区域来恢复凝结体形成，可以恢复基因激活和平滑肌细胞重新编程。这些发现表明，Myocardin凝结体的形成对于心血管分化过程中基因激活是必需的。研究者提出，在关键浓度的细胞类型特异性调节因子中形成的转录凝结体为发育过程中关键细胞身份基因的激活提供了一个分子开关[1]。

Myocardin在心脏基因激活中也发挥着重要作用。通过构建双顺反子慢病毒载体，能够表达心脏转录因子并带有不同的荧光跟踪信号。通过感染10T1/2成纤维细胞，研究者发现只有Tbx5+Myocd和Tbx5+Gata4+Myocd组合诱导了Myh6和Tnnt2心脏标记蛋白的表达。微阵列基因本体分析表明，Tbx5单独激活了Wnt受体信号通路中的基因，并抑制了多个心脏相关过程的基因。Myocd单独激活了多个心脏相关过程的基因，并抑制了Wnt受体信号通路和非心脏过程的基因。Gata4单独抑制了非心脏过程的基因。Tbx5+Gata4+Myocd是心脏相关过程基因激活最有效的激活剂。与Tbx5、Gata4和Myocd单独或Tbx5+Myocd相比，Tbx5+Gata4+Myocd激活了与非心脏过程相关的最少基因。这表明，Tbx5、Gata4和Myocd在哺乳动物非肌源性细胞的心脏基因激活中发挥着不同的作用。Tbx5+Gata4+Myocd激活了最多的心脏基因和最少非心脏基因的表达[3]。

此外，研究发现，冠状动脉疾病相关的基因TCF21通过阻断Myocardin-SRF通路来抑制平滑肌细胞的分化。TCF21表达抑制了广泛的平滑肌标记，以及关键平滑肌转录因子MYOCD和SRF的RNA和蛋白质水平。染色质免疫沉淀测序实验显示，SRF结合位点在人类冠状动脉平滑肌细胞中的结合与TCF21共定位，包括在SRF基因的一个新增强子中，以及在MYOCD基因启动子中。体外基因组编辑实验表明，SRF增强子CArG盒调节SRF基因的转录，而小鼠SRF增强子正交同源基因中的保守基序突变导致主动脉和心脏组织中的SRF表达降低。报告基因转染实验证实了TCF21在共定位位点上的直接结合和转录抑制。染色质免疫沉淀和蛋白质共免疫沉淀研究提供了证据，表明TCF21通过直接TCF21-MYOCD相互作用阻止MYOCD和SRF的关联。这些数据表明，TCF21通过多种机制拮抗MYOCD-SRF通路，进一步确立了TCF21在基本平滑肌过程中的作用，并表明了平滑肌对血管应激的反应和该细胞类型表型调节在冠状动脉疾病风险中的重要性[4]。

Myocardin在肺癌中也发挥着肿瘤抑制因子的作用。Myocardin缺失的NSCLC细胞对TGFBR激酶抑制剂（TGFBRi）特别敏感。TGFBRi和干细胞抑制剂与现有药物协同作用，治疗MYOCD缺失的肺癌。这项工作表明，MYOCD功能的丧失在肺癌细胞中创造了致命的弱点，这可能在临床中得到利用[5]。

在败血症相关急性肺损伤中，Myocardin和SRF介导的MLCK转录可以防止多形核中性粒细胞发生铁死亡。RNA测序发现肌球蛋白轻链激酶（MLCK）是模型小鼠和对照小鼠分离的PMN之间最显著差异表达的基因（DEG）。Myocardin（MYOCD）和血清反应因子（SRF）是两个可以促进MLCK转录的DEG，它们通过结合到其启动子上。敲低MLCK、MYOCD或SRF可以减轻LPS处理小鼠肺功能障碍和水肿。京都基因和基因组百科全书富集分析表明，DEG富集在铁死亡相关信号通路中。MLCK、MYOCD或SRF敲低增加了PMN中的ROS、MDA、铁蛋白和亚铁离子的含量，并降低了GSH和GPX4的水平。然而，MLCK过表达恢复了铁死亡抵抗和PMN的活性，导致肺损伤增加。总的来说，这项研究表明，MYOCD和SRF介导的MLCK上调与铁死亡抵抗和败血症相关急性肺损伤中PMN的超活化相关[6]。

在心力衰竭中，Myocardin信号传导的靶向基因沉默揭示了其功能意义。Myocardin是一种强大的平滑肌（SM）和心脏基因的转录共激活因子，在动物模型和人类终末期心力衰竭（HF）的心肌中上调。然而，HF中myocd上调的分子和功能后果尚不清楚。研究者使用多柔比星（Dox）诱导的舒张性心力衰竭（DHF）模型来研究是否可以靶向抑制myocd的表达来影响衰竭心脏的基因表达和功能。结果显示，在DHF猪模型中，myocd及其依赖的SM标记基因在衰竭的左心室心肌中被高度激活。研究者发现，在第2天，向衰竭心肌内递送设计用于靶向猪心脏中表达的myocd变体的短发夹RNA，导致myocd和myocd依赖的SM标记基因的激活表达下降到健康对照组动物的水平，改善了舒张功能障碍，并提高了DHF猪的存活率。在第7天恢复升高的myocd表达导致衰竭的左心室心肌中myocd依赖的SM标记基因的过表达，与舒张功能改变相关。这些数据首次表明，适度抑制（例如，正常化）衰竭心脏中激活的MYOCD信号可能具有治疗意义[7]。

此外，研究发现，肌动蛋白相关蛋白5（ARP5）抑制了Myocardin和MEF2对心脏基因转录的协同激活。Myocardin是心脏和平滑肌发育的重要转录因子。研究者先前发现，ARP5与MYOCD的N末端结合。研究结果表明，ARP5抑制了心脏特异性MYOCD与MEF2的协同作用。ARP5在鼠心中的过表达诱导了心脏肥大和纤维化，而P19CL6细胞中ARP5的敲低显著增加了心脏基因的表达。研究发现，ARP5与心脏MYOCD的MEF2结合位点结合，并通过MYOCD抑制MEF2介导的转录激活。RNA-seq分析揭示了849个由MYOCD-MEF2上调的基因和650个由ARP5抑制的基因。研究发现，随着心肌病的发生，ARP5的表达增加，并与由心脏MYOCD-MEF2调节的Tnnt2和Ttn的表达呈负相关。这些数据表明，ARP5是心脏MYOCD在生理和病理过程中的潜在抑制剂[8]。

综上所述，Myocardin作为一种重要的转录共激活因子，在心血管细胞谱系特化、心脏基因激活、平滑肌细胞分化、肺癌发生和败血症相关急性肺损伤中发挥着重要作用。Myocardin的功能异常与多种疾病相关，包括心力衰竭、癌症、急性血管疾病和糖尿病。此外，Myocardin的研究还揭示了其在基因表达调控和细胞命运决定中的重要作用。因此，深入研究和理解Myocardin的功能和调控机制，对于疾病的治疗和预防具有重要意义。