Cnot1-KO 基因敲除小鼠

Cnot1基因编码的蛋白是CCR4-NOT复合体的中心组成部分，该复合体在基因表达调控、RNA脱腺苷化和蛋白泛素化中发挥重要作用。Cnot1基因的突变与多种神经发育障碍相关，包括智力障碍、运动发育迟缓、语言发育迟缓、癫痫、肌张力低下和行为问题。研究发现，Cnot1基因的杂合子de novo变异与神经发育迟缓相关，这些变异包括错义、剪接位点和无义变异。为了研究Cnot1功能异常与神经发育表型的关系，研究者构建了特异性Cnot1敲低果蝇模型，发现Cnot1敲低会导致学习和记忆缺陷。引入人源野生型Cnot1可以挽救这一表型，而突变体则无法或只能部分挽救，这支持了Cnot1功能异常导致神经发育迟缓的假设。此外，Cnot1基因与自闭症谱系基因（如ASH1L、DYRK1A、MED13和SHANK3）的遗传相互作用在果蝇模型中受损。Cnot1基因变异的分子特征分析显示，突变型和野生型等位基因的表达水平相似。与复合体其他成员的蛋白质-蛋白质相互作用分析表明，CCR4-NOT复合体结构保持完整。整合患者来源的基因组和转录组数据表明，de novo Cnot1变异对内切核酸酶介导的无义介导的mRNA降解成分的影响很小，提示这些变异可能是haploinsufficient hypomorph或neomorph，而不是显性负效[1]。

Cnot1基因的经典剪接位点变异（c.1343+1G>T）与神经发育障碍相关。为了研究Cnot1基因剪接位点变异对mRNA剪接的影响，研究者进行了体外minigene检测。结果显示，Cnot1基因剪接位点变异c.1343+1G>T导致第12外显子完全跳过，解释了患者的临床状况，并为该变异的临床意义提供了额外的遗传诊断证据。此外，研究者还探索了通过引入修饰的U1 snRNA来纠正剪接变异的影响。在哺乳动物细胞中进行的minigene表达实验表明，修饰的U1 snRNA可以部分纠正异常剪接模式，这为利用修饰的U1 snRNA中和不正确剪接模式的有害影响提供了强有力的证据，并显示出其在治疗中的潜力[2]。

CCR4-NOT复合体是真核细胞信使RNA（mRNA）稳定性的主要调控因子。翻译过程中慢速解码会促进CCR4-NOT与核糖体的结合，加速mRNA降解。研究发现，在哺乳动物细胞中，P位点的特定精氨酸密码子是招募人CNOT3（CCR4-NOT亚基）到核糖体的强信号。冷冻电子断层扫描和tRNA突变分析表明，特定精氨酸tRNA的D臂与CNOT3相互作用，促进其招募，而其他tRNA的D臂则与CNOT3发生空间冲突。这些效应将密码子含量与mRNA稳定性联系起来。因此，除了它们在解码中的传统功能外，tRNA在翻译过程中直接参与调节复合物的相互作用，这一机制被称为P位点tRNA介导的mRNA降解[3]。

Vissers-Bodmer综合征是一种常染色体显性遗传病，是一种神经发育障碍，特征为全身发育迟缓、智力障碍、肌张力低下和自闭症特征，具有高度变异的表型。该综合征是由CCR4-NOT转录复合体亚基1基因（CNOT1）的变异引起的。研究者利用全外显子测序在三个中国患者中鉴定了三个CNOT1基因的新变异，包括一个移码变异和两个错义变异，主要表现为发育迟缓、智力障碍和/或自闭症。有趣的是，这三个患者表现出包括隐性脊柱裂、马蹄形肾和牛奶咖啡斑在内的新的临床表现。移码变异p.Gly172Alafs*5，为de novo变异，导致蛋白质中产生一个提前的终止密码子，被归类为致病性。两个错义变异c.3451A>G（p.Asn1151Asp）和c.557C>T（p.Ser186Phe）被多种预测算法预测为有害，并在多种物种中具有高度保守性。此外，三维结构建模和预测表明，突变氨基酸的替换会降低CNOT1蛋白的稳定性。鉴于CNOT1是一个相对较新的疾病基因，研究者按照ClinGen标准操作程序评估了基因-疾病的有效性。现有证据支持基因-疾病关系为“确定性”级别。遗传发现为家庭再生育的遗传咨询提供了可靠的基础，并扩展了CNOT1相关Vissers-Bodmer综合征的遗传和表型谱[4]。

miRNA通过广泛影响蛋白质合成在多种生物学过程中发挥关键作用。miRNA与miRNA诱导的沉默复合体（miRISC）结合后，抑制目标mRNA的翻译并加速mRNA降解。mRNA的降解由CCR4-NOT脱腺苷酶复合体介导的poly(A)尾缩短启动，随后去除5'帽结构并进行外切核酸降解。研究发现，CCR4-NOT的大支架亚基CNOT1与翻译抑制因子和去帽激活蛋白DDX6直接相互作用。DDX6以类似于翻译起始因子eIF4A与eIF4G相互作用的方式与CNOT1的一个保守亚结构域结合。重要的是，破坏DDX6-CNOT1相互作用的突变会损害人细胞中miRISC介导的基因沉默。因此，CNOT1促进DDX6募集到miRNA靶向的mRNA上，使DDX6成为miRNA沉默途径的下游效应器[5]。

FMRP（Fragile X mental retardation protein）的缺乏导致脆性X综合征（FXS），这是一种自闭症谱系障碍。FMRP在人类胎儿大脑发育中的作用尚不清楚。研究发现，FMRP对人类和猕猴的胎儿大脑发育至关重要。FMRP缺乏的人胎儿皮层切片神经元和FXS患者干细胞衍生的神经元表现出线粒体功能障碍和过度兴奋。通过多组学分析，研究者确定了FMRP结合的mRNA和FMRP相互作用的蛋白，揭示了FMRP在人类胎儿发育中调节必需基因的先前未知作用。研究者证明，FMRP与CNOT1的相互作用维持了受体激活C激酶1（RACK1）的水平，RACK1是FMRP的一个物种特异性靶点。RACK1的遗传减少导致线粒体功能障碍和过度兴奋，类似于FXS神经元。最后，增强线粒体功能挽救了FMRP缺乏的皮层神经元在胎儿发育中的缺陷，表明针对线粒体功能障碍是潜在的治疗方法[6]。

昼夜节律时钟是一种内在的时间保持机制，驱动基因的节律性表达，控制行为和生理的24小时振荡模式。最近的研究表明，转录后机制对于控制节律性基因表达至关重要。通过poly(A)尾长度调控mRNA稳定性是其中一种机制。研究发现，编码CCR4-NOT脱腺苷酶复合体支架蛋白的Cnot1在主时钟下丘脑视交叉上核中高度表达。小鼠中Cnot1缺乏导致昼夜节律周期延长和多种时钟基因的mRNA和蛋白质表达模式改变，主要是Per2。Per2 mRNA在Cnot1+/-小鼠中表现出更长的poly(A)尾和增加的mRNA稳定性。CNOT1通过BRF1（ZFP36L1）招募到Per2 mRNA，BRF1本身与Per2 mRNA呈反相振荡。BRF1敲低导致Per2 mRNA稳定，导致PER2表达水平升高。这表明CNOT1在调节哺乳动物昼夜节律时钟中发挥作用[7]。

重复滥用甲基苯丙胺（METH）会导致依赖、精神症状反复发作、强迫性药物寻求行为和各种神经症状。这些长期的生物学变化可能与表观遗传机制相关；然而，METH使用与表观遗传机制之间的关联尚未得到充分研究。因此，研究者对METH依赖进行了表观基因组关联研究，使用了从24名METH依赖患者和24名正常对照的血液样本中提取的基因组DNA。所有参与者均为日本血统。研究者使用线性回归分析测试了METH依赖与DNA甲基化之间的关联。研究者发现，在四个CpG位点存在全表观基因组关联显著关联，其中一个发生在CNOT1基因中，另一个发生在PUM1基因中。研究者特别关注CNOT1和PUM1基因以及与其他几个基因的关联程度，这些基因表明与METH依赖存在一定程度的关联。在相对富集的基因本体术语中，研究者对mRNA代谢、呼吸体和兴奋性细胞外配体门控离子通道活性等术语感兴趣。在相对富集的京都基因与基因组通路中，研究者注意到几种神经疾病的通路。研究结果表明，与在其他精神疾病或神经退行性疾病中观察到的遗传变化类似，METH依赖患者的表观遗传机制也可能发生变化[8]。

HUSH复合体由TASOR、MPP8和Periphilin组成，招募组蛋白甲基转移酶SETDB1，以整合位点依赖性方式将H3K9me3抑制性标记扩散到基因和转基因上。这些抑制性标记的沉积导致异染色质形成并抑制基因表达，但其潜在机制尚不完全清楚。研究发现，TASOR沉默或HIV-2 Vpx表达（诱导TASOR降解）会增加来自HIV-1 LTR启动子的转录本在转录后水平的积累。此外，通过酵母双杂交筛选，研究者确定了新的TASOR伴侣，这些伴侣参与RNA代谢，包括RNA脱腺苷酶CCR4-NOT复合体支架CNOT1。TASOR和CNOT1协同抑制HIV从其LTR的表达。类似于裂殖酵母中发现的RNA诱导的转录沉默复合体，研究者证明TASOR与RNA外切体和RNA聚合酶II（主要在其延长状态下）相互作用。最后，研究者证明TASOR促进RNA降解蛋白与RNA聚合酶II的关联，并发现其在转录中心存在。总之，研究者提出了HUSH在转录和转录后水平抑制HIV前病毒表达的假设[9]。

亚单位1是碳分解代谢物阻遏蛋白4（CCR4）-负调控TATA（NOT）复合体（CNOT1）的支架蛋白。在先前的研究中，研究者报道了tristetraprolin（TTP）可以招募CCR4-NOT复合体亚单位7（CNOT7）到人肺微血管内皮细胞（HPMECs）中，以诱导细胞间黏附分子1（ICAM-1）和白细胞介素-8（IL-8）mRNA的降解。此外，研究者还证明TTP、CNOT7和CNOT1在HPMECs中形成复合体。然而，CNOT1是否参与TTP介导的ICAM-1和IL-8 mRNA降解尚不清楚。研究结果表明，CNOT1敲低增加了ICAM-1和IL-8 mRNA的稳定性和蛋白质表达水平。免疫荧光结果表明，CNOT1、CNOT7和TTP在细胞质中共定位。CNOT1沉默消除了CNOT7和TTP的共免疫沉淀。然而，CNOT7沉默并没有影响CNOT1和TTP的共免疫沉淀，TTP沉默也没有影响CNOT1和CNOT7的共免疫沉淀。这些结果与研究者先前的研究一起，确定了CNOT1为TTP和CNOT7的募集提供了一个平台，并参与了TTP介导的ICAM-1和IL-8 mRNA降解[10]。

综上所述，Cnot1基因在基因表达调控、RNA脱腺苷化和蛋白泛素化中发挥重要作用。Cnot1基因的突变与多种神经发育障碍相关，包括智力障碍、运动发育迟缓、语言发育迟缓、癫痫、肌张力低下和行为问题。Cnot1基因的变异可能是haploinsufficient hypomorph或neomorph，而不是显性负效。Cnot1基因的剪接位点变异可以通过引入修饰的U1 snRNA来纠正，显示出其在治疗中的潜力。Cnot1基因与自闭症谱系基因存在遗传相互作用。Cnot1基因的变异与Vissers-Bodmer综合征相关，并扩展了该综合征的遗传和表型谱。Cnot1基因与DDX6相互作用，促进miRNA介导的基因沉默。Cnot1基因在胎儿大脑发育中发挥重要作用，并可能成为潜在的治疗靶点。Cnot1基因参与调节哺乳动物昼夜节律时钟。Cnot1基因与甲基苯丙胺依赖相关，并可能通过表观遗传机制发挥作用。Cnot1基因与HUSH复合体协同抑制HIV的表达。Cnot1基因参与TTP介导的ICAM-1和IL-8 mRNA降解。Cnot1基因的研究有助于深入理解其在基因表达调控、RNA代谢和疾病发生中的作用机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。