Cacnb3-KO 基因敲除小鼠

Cacnb3，也称为钙通道β3亚基编码基因，是电压依赖性钙通道（VDCC）的β亚基编码基因之一。VDCC存在于大多数兴奋性细胞中，其正常调节的活性对许多关键生物学过程至关重要，因为这些过程对细胞内钙离子的浓度非常敏感。β亚基是细胞质钙通道的一部分，可以调节钙通道的功能，并需要增加质膜中功能性通道的数量。Cacnb3基因在许多生物学过程中发挥作用，包括细胞分化、发育、代谢和疾病发生。

Cacnb3基因在鼠胎盘中表现出特异性的时空表达模式。删除Cacnb3基因不会产生强烈的胎盘表型，这可能是由于其他编码CACNB亚基的基因的表达；然而，偶尔可以观察到迷路结构表型，其特征是胎儿血管密度降低和周细胞数量减少。Cacnb3表达的下调没有挽救种间杂交胎盘模型中的胎盘增生，这表明在增生性胎盘中的上调是一个下游事件[1]。

在朗格汉斯细胞（LCs）中，Cacnb3基因在响应刺激时被强烈上调。Cacnb3基因的两种异构体以及DC成熟标记Fscn1在原代鼠LCs中都被上调。其他抗原呈递细胞群，如骨髓来源的DCs、巨噬细胞和原代B细胞，在刺激过程中没有表现出Cacnb3表达的上调。在SP37A3细胞刺激过程中，钙通道活性的药理学抑制增强了它们的T细胞刺激能力，而L型VDCC的选择性抑制没有影响。两种Cacnb3异构体，与Fscn1类似，需要JNK和p38激酶活性才能上调刺激，并且这个过程被ERK和PI(3)K抑制。我们发现，Cacnb3异构体2的假定的启动子区域不如Cacnb3异构体1普遍表达，在LC样细胞系中表现出报告活性。我们的发现表明，Cacnb3在特定的激活DC细胞群中发挥其功能。对这些DC亚群中Cacnb3表达刺激诱导上调的调节区域（s）的进一步分析将有助于更好地了解DC亚群特异性基因调节[2]。

Cacnb3基因在胰岛素分泌和糖尿病中发挥重要作用。破坏Ppp1r1a基因与胰岛素分泌减少和葡萄糖摄取受损有关；然而，细胞活力、ROS、凋亡或增殖保持不变。Ppp1r1a破坏后，观察到关键β细胞功能基因如Ins1、Ins2、Pcsk1、Cpe、Pdx1、Mafa、Isl1、Glut2、Snap25、Vamp2、Syt5、Cacna1a、Cacna1d和Cacnb3的表达显著下调。此外，在INS-1细胞中沉默Pdx1会改变PPP1R1A的表达，这表明PPP1R1A是PDX1的靶基因。罗格列酮治疗增加了Ppp1r1a的表达，而二甲双胍和胰岛素没有影响。RNA-seq分析显示，人类胰岛中PPP1R1A的表达很高，α细胞与其他内分泌细胞相比表现出最高的水平。肌肉组织比胰腺胰岛、肝脏或脂肪组织表现出更高的PPP1R1A表达。共表达分析揭示了PPP1R1A与胰岛素生物合成、胞吐作用机制和细胞内钙运输相关基因之间的显著相关性。在人类胰岛中过度表达PPP1R1A增强了胰岛素分泌，并上调了胰岛素、MAFA、PDX1和GLUT1的蛋白质表达，而沉默PPP1R1A降低了胰岛素、MAFA和GLUT1的蛋白质水平。这项研究为了解PPP1R1A在调节β细胞功能和葡萄糖稳态中的作用提供了宝贵的见解。PPP1R1A为未来的治疗干预提供了有希望的途径[3]。

snoRNA在小核RNA（snoRNA）中，小核RNA是一种小非编码调节RNA，近年来已被广泛研究。然而，snoRNA与青光眼之间的关系尚不清楚。这项研究旨在分析伪剥脱性青光眼（PEXG）患者与一组对照组相比，房水（AH）中snoRNA的表达水平，并确定假定的snoRNA依赖性机制，这些机制可能有助于PEXG。我们从18名白人患者中获得了AH，包括9名PEXG和9名年龄匹配的对照组患者。RNA被分离，并使用微阵列系统确定snoRNA表达谱。进行了功能富集分析。我们在PEXG和对照组患者的AH中发现了7个snoRNAs，包括SNORD73B、SNORD58A、SNORD56、SNORA77、SNORA72、SNORA64和SNORA32。PEXG组的5个snoRNAs的表达显著低于对照组，而PEXG组的2个snoRNAs的表达显著高于对照组。此外，我们确定了2个因素-CACNB3针对SNORA64和TMEM63C针对SNORA32，类似于PEX相关基因（CACNA1A和TMEM136）。针对snoRNAs的4个基因的富集分析揭示了与青光眼和/或PEX相关的可能机制，但没有证实snoRNAs在这些生物学过程中的直接作用[4]。

抗高血压药物已知可降低心血管死亡率，但不同类型的抗高血压药物在寿命中的作用尚未阐明。此外，潜在的机制尚不清楚。为了最大限度地减少混杂因素，我们使用孟德尔随机化来评估不同类型的抗高血压药物对寿命的作用，并通过蛋白质检查潜在的途径。与药物靶基因相关的收缩压（SBP）的遗传变异被用作遗传工具。从包含100万欧洲参与者的UK Biobank和LifeGen的大规模全基因组关联研究中获得了与寿命相关的遗传关联。对于有意义的抗高血压药物类别，我们进行了性别特异性分析、药物靶点分析和共定位。为了检查介导途径，我们评估了2291种血浆蛋白质与寿命的关联，并检查了药物类别与影响寿命的蛋白质的关联。在多重测试校正后，遗传上代理的β受体阻滞剂（BBs）、钙通道阻滞剂（CCBs）和血管扩张剂与更长的寿命相关（BBs：2.03，95% CI 0.78-3.28每5mmHg的SBP降低，CCBs：3.40，95% CI 1.47-5.33，血管扩张剂：2.92，95% CI 1.08-4.77）。BBs和CCBs的有益作用在男性中更为明显。ADRB1、CACNA2D2、CACNB3、CPT1A、CPT2和EDNRA基因与寿命延长相关，其中CPT2进一步得到共定位证据的支持。与寿命相关的86种蛋白质中，有4种蛋白质受到CCBs的影响。CDH1可能介导CCBs与寿命之间的关联。β受体阻滞剂、钙通道阻滞剂和血管扩张剂可能会延长寿命，BBs和CCBs的潜在性别差异。CCBs在寿命中的作用部分是通过CDH1介导的。优先考虑潜在的蛋白质靶点可以为健康老龄化提供新的见解[5]。

钙通道基因与双相情感障碍相关，调节锂对昼夜节律的放大作用。双相情感障碍（BD）与情绪发作和低振幅昼夜节律相关。之前，我们证明来自BD患者的成纤维细胞在锂处理后，与对照细胞相比，昼夜节律的放大作用较弱。由于钙信号影响昼夜节律，L型钙通道（LTCC）已被确认为BD的遗传风险因素，我们检查了LTCC功能丧失是否解释了BD细胞对锂的减弱反应。我们使用荧光染料来测量BD和对照成纤维细胞在锂治疗后的Ca2+变化，并使用生物发光报告基因来测量来自BD患者、人类对照和老鼠的成纤维细胞中的Per2::luc节律，同时通过药理学或基因操作钙通道。纵向表达LTCC基因（CACNA1C、CACNA1D和CACNB3）在BD和对照细胞中持续12-24小时。我们的结果表明，与LTCCs无关，锂在BD与对照成纤维细胞中刺激细胞内Ca2+的效果较差。在纵向研究中，LTCCs的药理学抑制或CACNA1A、CACNA1C、CACNA1D和CACNB3的敲低改变了昼夜节律的振幅。地尔硫卓和CACNA1C或CACNA1D的敲低消除了锂放大节律的能力。CACNA1A或CACNB3的敲低改变了基线节律，但没有影响锂对节律放大的影响。在人成纤维细胞中，CACNA1C基因型预测了锂的振幅反应，BD与对照细胞中CACNA1C、CACNA1D和CACNB3的表达谱发生了改变。我们得出结论，在BD患者的细胞中，钙信号异常，LTCCs是锂无法放大昼夜节律的原因[6]。

在颞叶癫痫中，电压门控Ca2+通道β3亚基的差异表达。这项研究的目的是从人类颞叶癫痫（mTLE）中先前通过转录组分析鉴定的差异表达基因（DEGs）开始，识别和验证新的潜在的药物靶点。我们在两个独立的mTLE转录组数据集中确定了共识DEGs，并赋予它们“领先靶点”状态，如果它们（1）参与神经元兴奋性，（2）在mTLE中是新的，并且（3）是可药物治疗的。为此，我们在STRING中创建了一个共识DEG网络，并使用DISEASES数据库和目标中央资源数据库（TCRD）中的信息对其进行注释。接下来，我们使用qPCR、免疫组织化学和Western blot在mTLE患者和癫痫对照患者的海马和颞叶新皮质组织中验证了领先靶点。在这里，我们从两个mTLE显著DEGs列表（分别为3040个和5523个）中创建了一个包含113个共识DEGs的稳健、无偏见的列表，并确定了五个领先靶点。接下来，我们表明CACNB3，一种电压门控Ca2+通道亚基，在mTLE中在mRNA和蛋白质水平上均显著调节。考虑到Ca2+电流在调节神经元兴奋性中的关键作用，这表明CACNB3在癫痫发作的发生中发挥作用。这是首次将CACNB3表达的改变与耐药性癫痫相关联，由于缺乏治疗耐药性mTLE的有效治疗方法，我们的发现可能代表设计这种新治疗策略的一步[7]。

微重力对小鼠脑基因表达的影响。重力变化，如宇航员在太空飞行期间经历的变化，导致体液从尾侧向头侧部分重新分布，并消除了正常的头至脚静水压梯度。为了评估与微重力和体液转移相关的脑基因谱变化，我们使用cDNA微阵列对2周龄对照组和后肢卸载（HU）小鼠的脑中mRNA表达水平进行了大规模分析。尽管程度不同，但所有功能类别都显示出显著调节的基因，这表明HU诱导了大量的转录组改变。有趣的是，TIC类别（小分子和离子进入细胞的转运）上调基因的百分比最高，而JAE类别（细胞连接、粘附、细胞外基质）下调基因最多。TIC基因包括16%的基因表达发生改变的基因，包括钠通道、非电压门控1β（Scnn1b）、谷氨酸受体（Grin1）、电压依赖性阴离子通道1（Vdac1）、钙通道β3亚基（Cacnb3）等。通过GeneMAPP进行的分析揭示了多种改变的蛋白质类别和功能途径，如凝血、免疫反应、学习和记忆、离子通道和细胞连接。特别是，数据表明HU导致止血的改变，使血液向更易形成血栓的状态转变，增加了静脉血栓形成的风险。此外，HU处理似乎影响了突触可塑性和学习过程的关键步骤[8]。

在发情前期，卵巢激素环境的变化改变了GnRH神经元的生理特性，并有助于GnRH峰的发育。我们假设发情前期也影响小鼠GnRH神经元中不同离子通道基因的表达。因此，我们对从完整、发情前期和发情后期GnRH-GFP转基因小鼠中收集的GnRH神经元进行了基因表达谱分析。发情前期改变了37种离子通道和8种钙稳态调节基因的表达。电压门控钠通道通过上调三种α亚基（Scn2a1、Scn3a和Scn9a）做出反应。在电压门控钾通道类别中，Kcna1、Kcnd3、Kcnh3和Kcnq2被上调，而其他（Kcna4、Kcnc3、Kcnd2和Kcng1）则下调。发情前期也对内向整流钾通道亚基产生了影响，表现为Kcnj9和Kcnj10基因的表达增强，而Kcnj1、Kcnj11和Kcnj12亚基基因的表达下调。两孔结构域钾通道也表现出差异表达，Kcnk1上调，三种亚基基因（Kcnk7、Kcnk12和Kcnk16）的表达降低。氯通道的改变涉及电压门控（Clcn3和Clcn6）和细胞内（Clic1）亚型。关于电压门控钙通道的孔形成α-1亚基，有两种（Cacna1b和Cacna1h）被上调，而Cacna1g下调。辅助亚基也被差异调节（Cacna2d1、Cacna2d2、Cacnb1、Cacnb3、Cacng5、Cacng6和Cacng8）。此外，ryanodine受体1（Ryr1）基因下调，而瞬时受体电位阳离子通道（Trpm3）基因表现出增强表达。编码调节细胞内钙稳态的蛋白质的基因也受到影响（Calb1、Hpca、Hpcal1、Hpcal4、Cabp7、Cab39l和Cib2）。在发情后期，GnRH神经元中编码离子通道蛋白的基因的差异表达表明，改变激素环境有助于重塑GnRH神经元的各种离子通道，这可能是GnRH神经元细胞活性增强和随后的神经激素释放增加的先决条件[9]。

Cavβ3以细胞自主方式调节胰腺β细胞中的Ca2+信号和胰岛素表达。电压门控Ca2+（Cav）通道由一个孔形成Cavα1亚基和辅助Cavα2-δ和Cavβ亚基组成。在成纤维细胞中，Cavβ3作为Cav亚基，减少了低浓度三磷酸肌醇（IP3）的敏感性。同样，Cavβ3可以影响胰腺β细胞中的细胞质钙浓度（[Ca2+]）。在这项研究中，我们使用CRISPR/Cas9在胰岛素分泌大鼠β-（Ins-1）细胞中删除了编码Cavβ3的基因Cacnb3。这些细胞被用作对照，以研究Cavβ3对野生型细胞中Ca2+信号、葡萄糖诱导的胰岛素分泌（GIIS）、Cav通道活性和基因表达的影响，其中Cavβ3和IP3受体被共免疫沉淀。转录和蛋白质分析显示，Cavβ3敲除细胞中胰岛素转录因子Mafa、CaMKIV、前蛋白转化酶枯草杆菌/凝血酶原类型-1和一氧化氮合酶-1的水平显著升高。在没有Cavβ3的情况下，Cav电流没有改变。相反，CREB活性、MAFA蛋白的量、GIIS的量、IP3依赖性Ca2+释放的程度和Ca2+振荡的频率都增加了。这些过程以浓度依赖性方式被Cavβ3蛋白降低。我们的研究表明，Cavβ3与分离的β细胞中的IP3受体相互作用，独立于Cav通道功能控制IP3依赖性Ca2+信号，从而以细胞自主方式调节胰岛素表达和其葡萄糖依赖性释放[10]。

综上所述，Cacnb3基因在多种生物学过程中发挥作用，包括胎盘发育、免疫反应、胰岛素分泌和昼夜节律调节。Cacnb3基因的表达和功能受到多种因素的调节，包括激素环境、药物和遗传变异。Cacnb3基因的异常表达和功能与多种疾病相关，包括胎盘增生、双相情感障碍和颞叶癫痫。研究Cacnb3基因有助于深入理解其生物学功能和疾病发生机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。