Znrf3-KO 基因敲除小鼠

基因Znrf3，也称为锌和环指3，是一种重要的E3泛素连接酶，参与调控Wnt信号通路。Wnt信号通路在许多生物学过程中发挥着关键作用，包括细胞分化、发育、代谢和疾病发生。Znrf3通过泛素化降解Wnt受体Frizzled，从而抑制Wnt信号通路的活性。Znrf3的异常表达或突变与多种癌症的发生和发展密切相关。

Znrf3与Rnf43共同作用，维持Wnt信号通路的平衡。Rnf43和Znrf3都是Wnt信号通路的负调控因子，它们通过泛素化降解Wnt受体Frizzled，从而抑制Wnt信号通路的活性。Rnf43和Znrf3的异常表达或突变会导致Wnt信号通路的过度激活，从而促进癌症的发生和发展。Rnf43和Znrf3的突变与多种癌症的发生和发展密切相关，包括结直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌。Rnf43和Znrf3的突变会导致Wnt信号通路的过度激活，从而促进癌症的发生和发展。

Znrf3的突变与肝脏疾病的发生和发展密切相关。肝脏特异性缺失Znrf3会导致脂肪性肝炎和肝细胞再生缺陷，从而增加患肝细胞癌的风险。Znrf3突变肝细胞癌患者预后较差，肝脏脂质代谢紊乱和脂肪性肝炎/非酒精性脂肪性肝病（NASH）特征明显。这些发现提示Znrf3可能通过控制肝细胞的增殖/分化和脂质代谢状态来促进肝细胞癌的发生。这两种机制共同促进癌变的进展。这些发现可能有助于管理那些Znrf3突变个体，他们有患脂肪肝和/或肝细胞癌的风险[1]。

Znrf3在肠干细胞自我更新过程中发挥重要作用。Lgr5是Wnt信号通路的靶基因，也是多种Wnt驱动的成人干细胞类型的精致标志。Lgr5和它的同源物Lgr4和Lgr6构成了R-spondins的受体，R-spondins是强大的Wnt信号增强剂和干细胞生长因子。Lgr5/R-spondin复合物通过中和Rnf43和Znrf3，两种从干细胞表面去除Wnt受体的跨膜E3连接酶，发挥作用。Rnf43/Znrf3本身由Wnt靶基因编码，构成了一个负反馈回路。因此，成人干细胞受到强大的Wnt激动剂、拮抗剂和反拮抗剂的复杂相互作用控制[2]。

Znrf3在慢性炎症、器官纤维化和与经典Wnt/β-catenin信号通路激活相关的癌症的预防和治疗中发挥重要作用。β-catenin/CTNNB1是一种细胞内支架蛋白，与粘附分子（E-cadherin/CDH1、N-cadherin/CDH2、VE-cadherin/CDH5和α-catenins）、跨膜型粘蛋白（MUC1/CD227和MUC16/CA125）、信号调节因子（APC、AXIN1、AXIN2和NHERF1/EBP50）以及表观遗传或转录调节因子（BCL9、BCL9L、CREBBP/CBP、EP300/p300、FOXM1、MED12、SMARCA4/BRG1和TCF/LEF）相互作用。β-catenin信号通路参与肌成纤维细胞活化和随后的肺纤维化，以及其他类型的纤维化。β-catenin和NF-κB信号通路的激活参与胃中幽门螺杆菌（H.pylori）感染和肝中丙型肝炎病毒（HCV）感染和其他病因相关的原位癌变。β-catenin靶向治疗药物根据其作用机制被分为靶向上游调节因子的β-catenin抑制剂（AZ1366、ETC-159、G007-LK、GNF6231、ipafricept、NVP-TNKS656、rosmantuzumab、vantictumab、WNT-C59、WNT974和XAV939）、靶向蛋白质-蛋白质相互作用的β-catenin抑制剂（CGP049090、CWP232228、E7386、ICG-001、LF3和PRI-724）、靶向表观遗传调节因子的β-catenin抑制剂（PKF118-310）、靶向中介复合物的β-catenin抑制剂（CCT251545和cortistatin A）以及靶向跨膜型转录产物的β-catenin抑制剂，包括CD44v6、FZD7和LGR5。根除H.pylori和HCV是预防胃癌和肝细胞癌（HCC）的最优方法。然而，β-catenin抑制剂可能适用于预防器官纤维化、HCC的二线预防和治疗β-catenin驱动的癌症。与β-catenin相关的人类疾病的分层预防和治疗策略对于实现个性化医疗和精准医疗的实施至关重要[3]。

Znrf3在癌症的发生和发展中发挥重要作用。RNF43和ZNRF3被认为是维持Wnt受体在最低必要水平的重要调节因子。在各种癌症类型中，特别是胃肠道肿瘤，这些基因的突变会导致β-catenin信号的异常Wnt依赖性激活。然而，最近的研究表明RNF43/ZNRF3也参与调节其他与肿瘤相关的蛋白质，包括EGFR、BRAF和骨形态发生蛋白（BMP）信号通路，这可能对肿瘤生物学有重要意义。此外，我们还详细描述了磷酸化和泛素化如何微调RNF43和ZNRF3的活性。我们还讨论了癌症中观察到的各种突变，以及它们支持肿瘤生长的机制，并挑战了特定错义突变在R-spondin和RING结构域中可能具有显性负活性，从而促进肿瘤形成的普遍观点[4]。

Znrf3在受体降解中发挥重要作用。大多数当前靶向质膜受体的治疗药物通过拮抗配体结合或酶活性发挥作用。然而，典型的哺乳动物蛋白质包含多个执行离散但协调活动的结构域。因此，抑制一个结构域通常不能完全抑制蛋白质的功能。事实上，靶向蛋白质降解技术，包括蛋白酶体靶向嵌合体1（PROTACs），突出了与抑制相比靶向降解在临床上的重要优势。然而，在需要口服生物利用度的情况下，生成结合两个靶点具有高亲和力的异源双功能化合物是复杂的。在这里，我们描述了蛋白酶体靶向抗体（PROTABs）的开发，它们将细胞表面E3泛素连接酶与跨膜蛋白连接起来，导致在体外和体内靶向降解。重点关注锌和环指3（ZNRF3），一种Wnt反应性连接酶，我们表明这种方法可以实现对结直肠癌的特异性降解。值得注意的是，通过检查额外的细胞表面E3泛素连接酶和跨膜受体的矩阵，我们证明这项技术适用于“按需”降解。此外，我们还提供了关于通过工程优化抗体格式来控制靶向降解的基础规则的见解。总之，这项工作描述了一种快速开发强效、生物可利用和组织选择性的细胞表面蛋白质降解剂的战略[5]。

Znrf3在肠干细胞自我更新过程中发挥重要作用。经典的Wnt/β-catenin信号通路调控着各种发育、稳态和病理过程。棕榈酰化的Wnt配体与细胞表面Frizzled（FZD）受体和LRP5和LRP6共受体结合，使β-catenin核转位和TCF/LEF依赖性基因转录激活。Wnt下游信号通路成分的突变揭示了Wnt配体本身的多种功能。然而，19种哺乳动物Wnt蛋白和10种FZD受体的冗余性和Wnt疏水性使得很难将这些功能直接归因于Wnt配体。例如，Wnt配体的个别突变没有揭示肠道上皮中的稳态表型——这是一种典型的依赖经典Wnt通路的快速自我更新的组织，其再生由增殖性隐窝Lgr5+肠干细胞（ISCs）提供动力。R-spondin配体（RSPO1-RSPO4）与不同的LGR4-LGR6、RNF43和ZNRF3受体类别结合，显著增强经典Wnt/β-catenin信号通路，并在体外诱导肠道类器官生长和体内Lgr5+ ISCs。然而，Wnt和RSPO配体在体内经典Wnt信号通路和ISC生物学中的作用、互换性、功能合作和相对贡献仍然未知。在这里，我们确定了Wnt和RSPO配体在肠道隐窝干细胞龛位中的功能作用。我们表明，Lgr5+ ISCs的默认命运是分化，除非RSPO和Wnt配体都存在。然而，使用RSPO配体和新非脂质化Wnt类似物进行的增益功能研究揭示，这些配体在ISCs中具有定性的、非可互换的、非互换的作用。Wnt蛋白无法诱导Lgr5+ ISC自我更新，而是通过维持RSPO受体表达来赋予基础能力，使RSPO配体能积极驱动并确定干细胞扩张的程度。这种功能上非等效但协作的Wnt和RSPO配体之间的相互作用为哺乳动物干细胞通过不同的启动和自我更新因子进行调节建立了分子先例，对精确控制组织再生具有重要意义[6]。

Znrf3和Rnf43共同作用，维持肝脏稳态。AXIN2和LGR5标记需要WNT/β-Catenin信号通路进行恒定稳态增殖的肠干细胞（ISCs）。相反，AXIN2/LGR5+外周肝细胞表现出低增殖率，尽管需要WNT/β-Catenin活性梯度来进行代谢性肝脏分区。限制AXIN2+肝细胞增殖和AXIN2+ ISCs代谢基因表达的机制仍然不清楚。我们现在表明，ISCs中受限的染色质可及性阻止了β-Catenin调节的代谢酶的表达，而通过Znrf3和Rnf43对WNT/β-Catenin活性的微调限制了染色质允许的AXIN2+肝细胞的增殖，同时保持了代谢功能。Znrf3的缺失促进了肝细胞增殖，随后RNF43的上调限制了这种增殖。在Znrf3突变小鼠中同时缺失RNF43会导致门静脉肝细胞的代谢重编程，并在一部分肝细胞中诱导克隆扩张，最终促进肝肿瘤。总的来说，Znrf3和Rnf43通过空间和时间上限制WNT/β-Catenin活性，平衡代谢功能和肝细胞增殖，共同保护肝脏稳态[7]。

Znrf3的突变与早期人类睾丸发育有关。46,XY差异/性发育障碍（DSD）的特点是表型谱广泛，从典型的女性到男性，具有未充分雄性化的外生殖器，或更罕见地，具有典型男性表型的睾丸退化。尽管在DSD的基因诊断方面取得了进展，但大多数46,XY DSD病例仍然是特发性的。为了确定46,XY DSD的遗传原因，我们研究了165名突尼斯血统的患者，他们表现出广泛的DSD表型。进行了核型分析、候选基因测序和全外显子测序（WES）。细胞遗传学异常，包括高频率的性染色体异常（85.4%），解释了队列中30.9%（51/165）的表型。候选基因的Sanger测序在一例46,XY性腺发育不全患者中发现了一个新的SRY基因致病性变异。对44名46,XY DSD患者的亚组进行外显子组筛选，发现38.6%（17/44）的患者存在致病性或可能致病性的变异。在AR、SRD5A2、ZNRF3、SOX8、SOX9和HHAT基因中发现了罕见或新的致病性变异。总的来说，我们的数据显示在46,XY DSD组中遗传诊断率为41.2%（68/165）[8]。

Znrf3在肾上腺稳态中发挥重要作用。空间和时间控制Wnt信号通路对于许多组织的发展和稳态至关重要。跨膜E3泛素连接酶Znrf3（锌和环指3）和Rnf43（环指蛋白43）通过促进Frizzled受体的降解来拮抗Wnt信号通路。Znrf3和Rnf43在人类癌症中频繁失活，但其分子和治疗意义尚不清楚。在这里，我们证明肾上腺皮质特异性缺失Znrf3（而不是Rnf43）会导致肾上腺增生，这取决于刺猬介导的Wnt配体分泌。此外，我们发现肾上腺皮质存在Wnt/β-catenin信号通路梯度，在Znrf3缺失时被破坏。与β-catenin功能获得模型不同，后者导致高Wnt/β-catenin激活和外围皮质的扩张，Znrf3缺失会触发中等水平的Wnt/β-catenin信号通路激活，从而驱动仅限于组织学上和功能上与外围皮质不同的内皮质增殖性扩张。通过遗传减少β-catenin的剂量可以显著逆转Znrf3缺失的表型。因此，肾上腺皮质的稳态维持依赖于不同水平的Wnt/β-catenin激活，这由Znrf3调节[9]。

Znrf3在Wnt受体调节中的分子机制尚不完全清楚，并且仍存在争议。Wnt信号通路在我们的整个生命中发挥着关键作用，从受孕到死亡，通过调节发育胚胎中的形态发生和成人组织稳态的维持。Wnt信号通路的调节发生在几个水平：在质膜上的受体水平，在细胞质中的β-catenin蛋白水平，以及在细胞核中的转录调节。最近的研究重点集中在Wnt受体调节的机制上，这是因为在发现Wnt受体Frizzled（Fzd）是泛素连接酶RNF43和ZNRF3的靶点之后。RNF43和ZNRF3是同源基因，在几种癌症中发生突变。它们的作用机制背后的细节仍在不断发展，同时提出了许多新的问题。在这篇综述中，我们讨论了我们对Wnt受体调节理解方面的进展和争议[10]。

综上所述，Znrf3是一种重要的E3泛素连接酶，参与调控Wnt信号通路，在多种生物学过程中发挥着关键作用。Znrf3的异常表达或突变与多种癌症的发生和发展密切相关，包括结直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌。Znrf3的突变与肝脏疾病的发生和发展密切相关，包括脂肪性肝炎和肝细胞再生缺陷，从而增加患肝细胞癌的风险。Znrf3在肠干细胞自我更新过程中发挥重要作用，与Lgr5/R-spondin复合物共同作用，调节Wnt信号通路的活性。Znrf3在慢性炎症、器官纤维化和与经典Wnt/β-catenin信号通路激活相关的癌症的预防和治疗中发挥重要作用。Znrf3在癌症的发生和发展中发挥重要作用，通过维持Wnt受体在最低必要水平来调节Wnt信号通路。Znrf3在受体降解中发挥重要作用，通过开发蛋白酶体靶向抗体（PROTABs）实现对结直肠癌的特异性降解。Znrf3在肠干细胞自我更新过程中发挥重要作用，与Wnt和RSPO配体相互作用，共同调节ISCs的自我更新。Znrf3和Rnf43共同作用，维持肝脏稳态，通过空间和时间上限制WNT/β-Catenin活性，平衡代谢功能和肝细胞增殖。Znrf3的突变与早期人类睾丸发育有关，与多种基因变异共同导致DSD的发生。Znrf3在肾上腺稳态中发挥重要作用，通过调节Wnt/β-catenin信号通路梯度来维持肾上腺皮质的稳态。Znrf3在Wnt受体调节中的分子机制尚不完全清楚，并且仍存在争议，需要进一步的研究来阐明。Znrf3的研究有助于深入理解Wnt信号通路的生物学功能和疾病发生机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。