Car9-KO 基因敲除小鼠

碳酐酶 IX（CA IX）是一种高度活跃的酶，具有粘附能力，在酸碱平衡和细胞间通讯中发挥重要作用。它通常存在于胃肠道上皮细胞的基底外侧膜上，并在各种癌症中异常表达。为了揭示其在生理上的重要性，研究人员克隆了 Car9 基因，并生成了 CA IX 缺陷小鼠。这些小鼠通过靶向基因破坏获得了 Car9 基因的纯合突变。通过组织化学和免疫组织化学技术确定了组织结构和标记物的表达。结果显示，纯合突变小鼠在出生后不久就出现了胃腺上皮的增生，并在 4 周龄时变得更加明显。CA IX 的丢失导致粘液分泌的腺细胞过度产生，而胃蛋白酶原阳性的主细胞耗尽。壁细胞的 H(+)/K(+)-腺苷三磷酸酶阳性比例显著降低，但其绝对数量并未减少。相应地，CA IX 缺陷小鼠具有正常的胃 pH 值、酸分泌和血清胃泌素水平。Car9 纯合突变导致的小鼠表型结果表明，CA IX 在控制细胞增殖和分化方面在腺性胃上皮的形态发生和稳态中发挥着重要作用[1]。

CA IX 缺陷小鼠的大脑表现出行为改变和脑组织形态学的破坏。行为测试显示，CA IX 缺陷小鼠表现出异常的运动活动，并在记忆测试中表现不佳。为了进一步确定大脑对 CA IX 缺陷的转录组反应，研究人员进行了全基因组 cDNA 微阵列分析。结果显示，与野生型小鼠相比，CA IX 缺陷小鼠的大脑中有 31 个基因上调，37 个基因下调。功能注释表明，上调表达的基因涉及多个过程，如 RNA 代谢，而下调表达的基因则参与其他重要过程，包括细胞离子稳态的调节。值得注意的是，“行为”和“运动行为”这两个生物学过程是下调基因中最突出的两个，与行为表型一致。这些结果表明，CA IX 可能直接或间接地在脑组织中发挥新的功能。此外，CA IX 缺陷小鼠的大脑表型似乎与年龄有关。这些结果表明，功能变化先于 CA IX 缺陷小鼠大脑中的微观改变[2]。

CA9 亲和标签是一种十二聚体硅酸盐结合肽，可以融合到感兴趣蛋白的 N 端和 C 端，使其能够在未衍生硅酸盐上进行快速且廉价的纯化。研究人员发现，硅纸离心柱和多孔板用于质粒 DNA 纯化，适用于以高纯度回收 CA9 标记蛋白，工作流程与高通量实验兼容。离心柱通常可以回收 100 微克生物活性物质，只需几分钟即可在低浓度赖氨酸中回收。由于它们的床长较短，离心柱还具有独特优势，如从与麦芽糖结合蛋白（MBP）折叠伴侣融合和自动裂解的烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶中选择性地回收功能性 CA9 标记烟草蚀刻病毒蛋白酶，在存在 NaCl 的情况下非特异性结合到硅酸盐上。这些额外的纯化模式应增加 CA9 标签亲和蛋白纯化的通用性和吸引力[3]。

在软骨细胞中，CA IX 的下调促进了 Col10a1 的表达。研究人员发现，在增殖的软骨细胞中，Car9 mRNA 和 CA IX 的表达，而在肥大的软骨细胞中没有表达。进一步研究发现，向来自肋软骨的鼠源原代软骨细胞中引入 Car9 siRNA 诱导了 Col10a1 和 Epas1 的 mRNA 表达，这两种基因在肥大的软骨细胞中特征性地表达。另一方面，CA IX 的强制表达对软骨细胞的增殖或 Col10a1 和 Epas1 的转录没有影响，而 Col2a1 和 Acan 的转录上调。尽管 HIF-2α 被报道是 Col10a1 转录的强效激活剂，但 Epas1 siRNA 并不能抑制 Car9 siRNA 诱导的 Col10a1 表达增加，这表明 CA IX 的下调以 HIF-2α 非依赖性方式诱导了软骨细胞中 Col10a1 的表达。另一方面，Car9 siRNA 降低了细胞内 cAMP 含量。此外，在 Car9 沉默后，Col10a1 mRNA 的表达通过蛋白激酶 A 抑制剂增强，并被磷酸二酯酶抑制剂以及 cAMP 的溴化类似物抑制。这些结果表明，cAMP 依赖性途径至少部分参与了 Car9 下调诱导的 Col10a1 表达，但需要更详细的研究来阐明 CA IX 在调节软骨细胞中 Col10a1 表达中的作用[4]。

JTC801 在癌细胞中诱导 pH 依赖性死亡，并减缓小鼠肿瘤生长。研究人员发现 JTC801 在癌细胞中诱导 pH 依赖性死亡（称为碱化性死亡），但在正常细胞或 C57BL/6 小鼠的健康组织中却没有这种作用。JTC801 通过激活 NF-κB 来诱导癌细胞中的碱化性死亡，而 NF-κB 会抑制 CA9 的表达，其产物调节细胞内的 pH 平衡。在分析癌症基因组图谱数据和组织微阵列时，研究人员发现 CA9 mRNA 或蛋白水平升高与胰腺癌、肾癌或肺癌患者的生存时间缩短相关。JTC801 可能被开发用于胰腺癌的治疗[5]。

在 CA II 缺陷（Car2-/-）和 CA IX 缺陷（Car9-/-）小鼠中，碳酐酶基因表达发生变化。研究人员使用实时 PCR 和免疫组化技术检测了野生型、CA II 缺陷和 CA IX 缺陷小鼠的大脑、肾脏、胃和结肠中碳酐酶同工酶 I、II、III、IV、IX、XII、XIII 和 XIV 的表达。结果显示，Car4、Car12、Car13 和 Car14 mRNA 的表达水平在三组小鼠之间没有显著差异，而两组 CA 缺陷小鼠的结肠中 Car1 的表达水平降低，肾脏中 Car3 的表达水平降低。Car2 mRNA 水平在所有四种组织中都显著降低，但在 Car2-/- 小鼠中并未完全消除，在这些小鼠中未检测到 CA II 蛋白的表达。测序 Car2 cDNA 发现了两个核苷酸差异，其中一个突变导致在密码子 155 处翻译提前终止（Gln155X）。Car9 mRNA 和 CA IX 蛋白表达水平在 Car2-/- 小鼠的胃中分别上调了 2.5 倍和 3.6 倍。这些结果表明，Car2-/- 小鼠胃中细胞质 CA II 功能的丧失导致了一种细胞外 CA，即 CA IX 的上调表达，CA IX 表达在胃上皮细胞的细胞表面[6]。

LOWER TEMPERATURE 1 通过调节 C2 结构域 ABA 相关蛋白的稳定性和定位来增强 ABA 反应和植物抗旱性。研究人员发现，LOT1 与 CAR9 物理相互作用，ABA 减少细胞核中 LOT1-CAR9 的相互作用，可能通过 Ca2+ 实现，导致 CAR9 增加定位到质膜。进一步研究发现，CAR9 的稳定性受 LOT1 的影响，lot1 中 CAR9 蛋白的积累减少，泛素化增加。虽然 lot1、car9 和 lot1 car9 突变体对 ABA 的敏感性降低，但 lot1 的低敏感性表型可以通过 CAR9 过表达得到挽救。这些研究表明，LOT1 通过调节 CAR9 的稳定性和动态定位来增强植物对干旱胁迫的耐受性[7]。

Car9 标签在硅酸盐基质上的亲和纯化：优化一种快速且廉价的蛋白质纯化技术。研究人员发现，Car9 标签在融合到目标蛋白的 N 端时具有功能，并且可以由 TEV 蛋白酶切割，支持在变性条件下进行亲和纯化，尽管产率较低。他们进一步证明，在存在 0.3% Tween 20 的情况下裂解细胞可以增强 CA9 标记蛋白在小粒径硅凝胶上的捕获，同时解决了非特异性蛋白吸附的问题，并且在碱性条件下降低赖氨酸浓度即可实现有效的洗脱。一个优化的小型纯化试剂盒结合上述特点，可以使 CA9 标记蛋白以低于 90% 的纯度在几分钟内以低成本回收。Car9 亲和纯化技术应证明对需要快速获得毫克级蛋白质的实验室规模应用以及成本和生产率是重要因素的准备规模纯化方案非常有价值[8]。

CA IX 在小鼠和人类中的差异。与人类 CA IX（hCA IX）在分子和功能特性、调节和表达方面进行了广泛的研究相比，小鼠同源基因主要在组织分布和 CA IX 缺陷小鼠的特征方面进行了研究。研究人员首次研究了 Car9 基因的转录调节，并详细描述了其启动子。此外，他们还进行了 mCA IX 蛋白的分析，重点关注 pH 调节、细胞间粘附和迁移。最后，他们揭示了 mCA IX 可溶性细胞外形式的缺失，并提供了 mCA IX 存在于外泌体中的首个实验证据。尽管 hCA IX 和 mCA IX 的蛋白特性高度相似，并且两个基因的转录主要由缺氧控制，但转录调节的某些属性对人类或小鼠是特异性的，因此可能导致组织表达和数据分析的差异[9]。

Betulinic 酸衍生物作为 PET 诊断剂用于缺氧诱导的碳酐酶 IX（CA IX）表达的评价。研究人员评估了 betulinic 酸（B-DOTA）和 betulinyl-3-sulfamate（BS-DOTA）在两种大鼠肿瘤细胞系（AT1 前列腺和 Walker-256 乳腺腺癌）中的结合情况。AT1 细胞在缺氧条件下以依赖性方式表达 CA IX，而 Walker-256 细胞在野生型中几乎不表达 CA IX，被转染了大鼠 Car9 基因。结果显示，在 AT1 细胞中，缺氧诱导的 CA IX 过表达导致 BS-DOTA 的结合增强，而 B-DOTA 的结合没有增强。BS-DOTA 的结合与 CA IX 蛋白表达呈线性相关，并且可以通过未标记的示踪剂过量的方式阻断。在转染的 Walker-256 细胞中，没有观察到两种示踪剂的特异性结合。体内实验中，在呼吸室内空气、8% 或 100% 氧气的大鼠 AT1 肿瘤中进行了测量。结果显示，在 AT1 细胞中，缺氧诱导的 CA IX 过表达导致 BS-DOTA 的结合增强，而 B-DOTA 的结合没有增强。BS-DOTA 的结合与 CA IX 蛋白表达呈线性相关，并且可以通过未标记的示踪剂过量的方式阻断。在转染的 Walker-256 细胞中，没有观察到两种示踪剂的特异性结合。体内实验中，在呼吸室内空气、8% 或 100% 氧气的大鼠 AT1 肿瘤中进行了测量。结果显示，在缺氧条件下，BS-DOTA 的肿瘤内积累增加，而在高氧条件下减少。因此，betulinyl-3-sulfamate 可以作为肿瘤中 CA IX 表达的 PET 诊断剂，并提供关于肿瘤氧合状态的信息。然而，积累数据表明，结合不仅取决于缺氧诱导的 CA IX 表达，还取决于肿瘤特异性基础表达和肿瘤的初始氧合状态[10]。

综上所述，Car9 基因编码的 CA IX 在多种生物学过程中发挥着重要作用，包括酸碱平衡、细胞间通讯、细胞增殖、分化和迁移。Car9 基因的突变或表达异常与多种疾病的发生和发展密切相关，如胃癌、脑部疾病和软骨细胞分化异常。Car9 基因的研究不仅有助于深入理解其在生理和病理过程中的作用机制，还为疾病的治疗和诊断提供了新的思路和策略。