Cpa2-KO 基因敲除小鼠

基因CPA2，即羧肽酶A2，是羧肽酶基因家族中的一个新成员。它最初是从大鼠胰腺cDNA克隆的预测氨基酸序列中被鉴定出来的。通过对CPA2 cDNA进行体内重组和原位杂交技术，研究者成功分离了两个跨越25千碱基对的大鼠CPA2基因的基因组克隆。通过构建已知胰腺羧肽酶的氨基酸序列的进化树，研究者发现CPA2和羧肽酶A1（CPA1）是基因在哺乳动物辐射之前复制的产物，而牛羧肽酶属于A1型。从大鼠胰腺分离的CPA1和CPA2的底物特异性与牛羧肽酶相似，即羧基末端具有芳香族或支链脂肪族侧链的氨基酸是首选的底物。然而，与牛羧肽酶相比，大鼠CPA1的底物偏好倾向于较小的氨基酸，而大鼠CPA2的底物偏好倾向于较大的氨基酸。这三种羧肽酶在底物特异性上的差异与其结合口袋中底物羧基末端氨基酸的氨基酸替换相一致[1]。

在对慢性胰腺炎（CP）的研究中，研究者对来自日本和德国的477名CP患者（234名酒精性，243名非酒精性）和497名非酒精性CP患者的CPA2和CPB1基因的所有外显子和侧翼内含子进行了测序。通过将CPA2和CPB1变异体转染到HEK 293T细胞中，研究者确定了CPA2变异体（p.V67I、p.G166R、p.D168E、p.D173H、p.R237W和p.G388S）和CPB1变异体（p.S65G、p.N120S、p.D172E、p.R195H、p.D208N、p.F232L、p.A317V和p.D364Y）的分泌和酶活性。功能性分析显示，CPA2变异体p.R237W和p.G388S以及CPB1变异体p.R110H和p.D364Y几乎完全失去了功能。然而，包括那些导致功能显著丧失的变异体在内，没有发现CPA2或CPB1变异体在CP患者中过度表达。因此，研究者得出结论，CPA2和CPB1变异体与CP没有关联[2]。

在胰腺导管腺癌（PDAC）的研究中，研究者通过RNA表达谱分析比较了PDAC和正常胰腺组织的基因表达。他们发现，在118个PDAC肿瘤样本和13个正常胰腺组织样本中，与正常胰腺组织相比，1502个基因上调，744个基因下调。蛋白质-蛋白质相互作用分析揭示了10个上调的枢纽基因（ITGB1、ITGAV、SDC1、KRAS、CCNB2、COL1A2、AURKA、CDC20、COL1A1、COL3A1）和10个下调的枢纽基因（CPB1、CPA1、CPA2、CTRB2、CTRC、CELA3A、CELA2B、PRSS3、CELA2A、REG1A）。研究者使用连通性映射（cMap）根据这些枢纽基因列表生成了PDAC治疗的候选药物，包括酪氨酸激酶抑制剂（lucitanib、lapatinib、ceritinib和CYT-387）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂（roscovitine、BS-181、purvalanol-a、MK-2206和palomid-529）和其他小分子。这些结果有助于集中精力识别具有潜在治疗效果的靶向药物，以在PDAC患者的临床试验中进行评估[3]。

在酵母菌的研究中，研究者发现δ-N-（磷酸乙酰）-L-鸟氨酸（PALO）在体内诱导了酵母菌的精氨酸限制。精氨酸限制导致HIS3和TRP5的表达增加，这是通过在携带每个基因启动子区域与大肠杆菌lacZ基因的整合融合的菌株中测定β-半乳糖苷酶活性来衡量的。PALO诱导的β-半乳糖苷酶活性的增加可以通过添加精氨酸来逆转，并且依赖于GCN4蛋白。这些结果表明，PALO可以像3-氨基-1,2,4-三唑DL-5-甲基色氨酸一样，用于研究单个氨基酸（精氨酸）的限制对在一般氨基酸控制调节系统下表达的基因的影响。由PALO引起的精氨酸剥夺还导致CPA1和CPA2的表达增加，分别编码精氨酸特异性羧酸磷酸合酶的小和大亚基。观察到的增加依赖于GCN4，并且与精氨酸特异性抑制CPA1 mRNA翻译独立。CPA1和CPA2的5'-侧翼区域包含至少两个TGACTC序列，这些序列已知可以结合GCN4蛋白。当两种菌株都在受抑制的条件下生长时，与野生型相比，gcn4突变菌株中从CPA1-和CPA2-lacZ融合中表达的β-半乳糖苷酶活性减少了五到六倍。gcn4突变降低了CPA1和CPA2的基线表达。向含有CPA1-lacZ融合的菌株中添加精氨酸进一步降低了gcn4突变体的β-半乳糖苷酶活性，这表明CPA1基因由一般氨基酸控制和精氨酸特异性抑制独立调节。在过量产生GCN4蛋白的菌株中，翻译控制完全取代了CPA1的转录激活[4]。

在人类染色体7q32上印记区域的扩展研究显示，与已知印记区域的邻近性表明这些CPAs可能具有印记效应。通过复制时间研究，研究者发现包括CPAs在内的广泛基因组区域复制不同步。随后，通过测序RT-PCR产物对CPA1、CPA2、CPA4和CPA5进行的SNP分析表明，CPA4具有优先表达的母系等位基因和脑中的双等位基因表达。CPA5的表达水平太低，无法进行可靠的等位基因表达评估，而CPA1和CPA2都显示出双等位基因表达。尽管这个基因家族位于印记簇旁边，但CPA4是这个家族中唯一显示出印记效应的基因。由于CPA4在细胞增殖和分化中具有潜在作用，在SRS患者中，两个优先表达的拷贝会导致过度表达，并可能改变这些受试者的生长模式，从而导致宫内生长受限[5]。

在急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中，研究者发现急性胰腺炎是精氨酸不耐受的常见原因之一。为了确定精氨酸不耐受性胰腺炎的临床风险因素，他们研究了5185名儿童和年轻成人ALL患者，包括117名（2.3%）在治疗期间被诊断为至少一次急性胰腺炎的患者。在队列和213名患者的独立病例对照组中进行了全基因组关联研究，以确定遗传风险因素。与胰腺炎相关的风险因素包括基因定义的印第安人血统（P < .001）、年龄较大（P < .001）和精氨酸累积剂量较高（P < .001）。在基因组关联研究中，没有常见变异体达到全基因组显著性，但在CPA2基因中，编码羧肽酶A2的罕见无义变异体rs199695765与胰腺炎高度相关（风险比，587；95% CI，66.8至5166；P = 9.0 × 10(-9)）。基因水平分析显示，与未发生胰腺炎的患者相比，患有胰腺炎的患者中CPA2的额外变异体过多（P = .001）。16个CPA2单核苷酸多态性与胰腺炎相关（P < .05），携带至少一个这些变异体的24名患者中有13名发生了胰腺炎。常见变异体与胰腺炎适度相关的生物功能包括嘌呤代谢和细胞骨架调节。在ALL患者中，年龄较大、精氨酸暴露较高和印第安人血统较高是胰腺炎的独立风险因素。那些在CPA2基因中遗传无义罕见变异体的人，患精氨酸诱导的胰腺炎的风险显著增加[6]。

在对真核生物钠/氢交换体（NHEs）的进化起源的研究中，研究者对超过200个注释为NHEs的基因进行了详细的系统发育分析。这项分析最初需要检查整个单价阳离子质子反向转运蛋白（CPA）超家族，该家族包括CPA1、CPA2和NaT-DC家族的转运蛋白，每个家族都有一组独特的细菌祖先。他们得出结论，有九个人类NHE（或SLC9A）旁系同源基因，以及两个以前未知的CPA2基因，他们将其命名为HsNHA1和HsNHA2。真核生物NHE家族由五个系统发育上不同的分支组成，这些分支在亚细胞定位、药物敏感性、阳离子选择性和序列长度方面有所不同。主要的分支是质膜（循环和驻留）和细胞内（内体/TGN、NHE8样和植物液泡）。HsNHE1是人类克隆的第一个真核生物NHE基因，属于驻留质膜分支。后者是最晚出现的，仅存在于脊椎动物中。相比之下，细胞内分支普遍分布，可能是质膜NHE的祖先。酵母内体ScNHX1是第一个被描述的细胞内NHE，与人类中的HsNHE6、HsNHE7和HsNHE9密切相关。他们的研究结果将NHE出现在动物细胞质膜上与使用Na+/K(+)-ATP酶生成膜电位联系起来。这些新颖的发现使他们能够使用比较生物学来预测九个人类NHE旁系同源基因的生理作用，并建议合适的模式生物来研究每个NHE亚类的独特特性[7]。

在对脑和其他非胰腺组织中的羧肽酶A（EC 3.4.17.1；CPA）基因转录本和相应催化活性的研究中，研究者发现两个已知CPA基因（CPA1和CPA2）的转录本在脑和几种其他非胰腺组织中含量极低。使用Northern印迹和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析，在脑、心脏、胃或结肠中发现的CPA1基因转录本的大小与胰腺中的大小相似（1.35千碱基）。然而，在脑、睾丸或肺中发现的CPA2基因转录本的大小较小（1.1千碱基）。使用各种探针的Northern印迹分析、RT-PCR和5'-快速扩增cDNA 5'-端（5' RACE）分析都表明，脑中转录本的较小大小是由于前mRNA的替代剪接产生的。这个过程对应于删除前四个外显子，导致编码一个蛋白质的mRNA，其中前前CPA2的信号肽和活化肽缺失，但活性位点仍然存在。预测较短的CPA2异构体，命名为CPA2(S)，应对应于一个细胞质金属肽酶，不需要胰蛋白酶活化，这一预测通过重组蛋白的特征和与脑中原始CPA样活性的比较得到了证实。从脑中分离的重组CPA2(S)和可溶性蛋白质在Western印迹上显示出相似的大小（与胰腺CPA2的34 kDa相比为32 kDa）。重组CPA2(S)和脑中的可溶性CPA样活性对一系列抑制剂显示出相似的敏感性，这与胰腺酶不同。研究者得出结论，替代剪接产生了一种截短的CPA2，具有不同的亚细胞定位和修改的催化活性。尽管存在CPA1 mRNA，但在脑提取物中甚至没有发现相应的CPA活性，即使在胰蛋白酶活化后也没有发现。这种明显的差异似乎可以归因于存在一种尚未确定的内源性肽抑制剂[8]。

在对大鼠肠系膜动脉床灌洗液中羧肽酶A1和A2（CPA1和CPA2）的分离研究中，研究者发现这些酶与它们的胰腺同源物相同。这些酶以不同的方式处理血管紧张素（Ang）I、Ang II、Ang-(1-9)和Ang-(1-12)，值得注意的是，CPA1催化的Ang II转化为Ang-(1-7)，以及CPA2介导的Ang I从Ang-(1-12)的形成。研究者检测到肠系膜和其他非胰腺组织中CPA1和CPA2的基因转录本，表明这些CPA可能在除其作为消化酶的功能之外的肾素-血管紧张素系统中发挥作用[9]。

在对隐球菌属的转基因诱导共抑制的研究中，研究者发现将DNA序列引入基因组通常会在各种生物体中导致同源依赖性基因沉默。他们之前在隐球菌属中表明，重复转基因阵列可以在交配期间以高频率（约50%）诱导基因沉默，但在营养生长期间以低得多（约0.2%）的频率诱导基因沉默。在这里，他们报告了一种由引入cpa1::ADE2转基因触发的营养生长过程中的稳健的共抑制现象。多个cpa1::ADE2转基因拷贝被外源整合到基因组中，导致内源性CPA1和CPA2基因沉默，这些基因编码环孢素A靶蛋白环孢素A。鉴于在沉默的分离株中检测到了来自CPA1的反义siRNA，并且RNAi成分（Rdp1、Ago1和Dcr2）对沉默是必需的，他们假设RNAi途径参与了这一过程，其中siRNA作为传递因子沉默CPA1和CPA2基因。CPA1和CPA2基因的沉默效率与转基因拷贝数相关，在存在超过25个转基因拷贝的情况下，沉默效率达到约90%。他们将这种转基因沉默现象称为无性共抑制，以区别于相关的性诱导沉默（SIS）过程。他们进一步表明，复制蛋白A（RPA），一种单链DNA结合复合物，对转基因沉默是必需的，这表明RPA可能在异常RNA产生中发挥与在Neurospora crassa中观察到的quelling相似的作用。有趣的是，他们还观察到，ADE2基因的沉默频率比CPA1/2基因低得多，尽管它存在于同一个转基因阵列中，这表明除了拷贝数之外，还有其他因素影响沉默。总的来说，他们的结果表明，在C. neoformans营养生长过程中存在一种由转基因诱导的共抑制过程，该过程与quelling具有共同的机制特征[10]。

综上所述，基因CPA2是一种在哺乳动物中发现的羧肽酶基因家族的新成员，具有独特的底物特异性和生物学功能。它在多种组织和细胞中表达，并参与多种生物学过程，包括消化、细胞增殖和分化等。CPA2的变异体和表达模式与某些疾病的发生和发展相关，如急性胰腺炎和PDAC。此外，CPA2的研究有助于深入理解羧肽酶基因家族的进化和功能，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。