Nek3-KO 基因敲除小鼠

NEK3，全称为NIMA-related kinase 3，是一种与NIMA（never in mitosis gene a）结构相关的蛋白激酶。NIMA是一种在真菌Aspergillus nidulans中控制有丝分裂的基因。人类NEK3基因通过RT-PCR克隆，其开放阅读框编码一个包含489个氨基酸残基的蛋白质，分子量约为56.0 kDa，预测等电点为6.58。系统发育分析表明，小鼠和人类的NEK3构成NIMA蛋白激酶家族的一个亚家族。NEK3在睾丸、卵巢和大脑中高水平表达，在大多数研究组织中低水平表达。NEK3 mRNA在所有增殖的细胞系中均可检测到，且其数量在细胞周期中不发生变化。人类NEK3基因定位于人类染色体13q14.2[1]。

NEK3介导SNAP29（synaptosomal-associated protein 29）的丝氨酸105（S105）磷酸化，影响其膜结合和SNARE融合依赖的过程。SNAP29是一种t-SNARE蛋白，参与细胞内运输过程中的多个融合事件，并影响高尔基体和局灶粘附的结构。NEK3介导的S105磷酸化导致SNAP29的膜结合，缺乏这种膜结合会导致细胞出现局灶粘附形成缺陷、高尔基体结构受损和细胞回收能力降低。与磷酸化缺陷的丝氨酸105至丙氨酸（S105A）突变体相比，野生型SNAP29部分挽救了CEDNIK（Cerebral dysgenesis, neuropathy, ichthyosis and palmoplantar keratoderma）患者来源的成纤维细胞的异常形态[2]。

NEK3与Vav2相互作用，通过人类催乳素受体调节信号传导。催乳素（PRL）受体激活对人类乳腺癌的进展和运动性有贡献。这一事件激活了包括Vav家族的鸟苷酸交换因子在内的多聚信号通路。NEK3与Vav1的相互作用通过共免疫沉淀分析得到证实。PRL刺激T47D细胞诱导NEK3激酶活性和Vav2/Nek3与PRL受体的相互作用。NEK3水平的增加上调了Vav2的丝氨酸和酪氨酸磷酸化，而NEK3敲低导致Vav2磷酸化减少。Rac-1的激活需要NEK3和Vav2，并且可以被过表达激酶失活的NEK3突变体抑制。然而，过表达NEK3或激酶失活的NEK3对Vav2增强的信号传导器与转录激活因子5（signal transducer and activator of transcription 5）介导的基因表达没有影响。在T47D细胞中过表达激酶失活的NEK3导致与对照相比细胞凋亡增加了50%。这些数据表明，PRL介导的NEK3激活差异性地参与了涉及Rac1和信号传导器与转录激活因子5的Vav2信号通路，并暗示NEK3在PRL介导的乳腺癌作用中发挥作用[3]。

NEK3在胃癌中的过表达与预后不良相关。NEK3在细胞迁移、增殖和细胞活力中发挥着重要作用。NEK3被报道可以增强乳腺癌的恶性程度。然而，其在胃癌中的作用尚未完全阐明。研究发现，与相邻的正常组织相比，NEK3 mRNA和蛋白质在胃癌组织中显著过表达。免疫组化染色分析显示，NEK3在胃癌样品中的高表达百分比高于相邻的正常样品。NEK3的过表达与胃癌的pT阶段、病理TNM阶段、淋巴结转移和不良预后显著相关。Cox多变量回归分析表明，NEK3是胃癌患者生存的独立预后因素。数据表明，NEK3在胃癌中过表达，促进了胃癌的恶性程度。NEK3可能作为胃癌的预后生物标志物和潜在的 therapeutic target[4]。

NEK3在小鼠中的克隆和表征表明，NEK3是一种新的哺乳动物基因产物，与真菌Aspergillus nidulans的细胞周期调节激酶NIMA结构相关。通过RNase保护实验，可以检测到NEK3在所有器官中的低水平表达，无论增殖指数如何。与NEK1和NEK2相比，NEK3在男性和女性生殖系中的水平没有特别升高。NEK3水平在细胞周期中的变化很小，但在G0阻滞的静息成纤维细胞中升高。此外，未检测到NEK3活性的细胞周期依赖性变化，且抗体微注射或过表达野生型或催化失活的NEK3对细胞周期进程没有影响。最后，NEK3主要是一种细胞质酶。这些数据表明，NEK3与先前描述的NEKs在所有研究的参数上都有所不同，包括器官特异性表达、细胞周期依赖性表达和活性以及亚细胞定位。因此，哺乳动物NEKs的结构相似性可能并不一定表明它们具有共同的功能，并且这个激酶家族的一些成员可能执行与细胞周期控制无直接关系的功能[5]。

NEK3的双等位基因失活突变导致α-微管蛋白脱乙酰化和NUP205下调，使个体易患与纤毛相关的异常心脏左右模式。本研究描述了两个不相关的家庭三联体，其心脏左右模式异常。通过全外显子测序（WES），在两个受影响个体中分别鉴定了NEK3编码的NIMA（never in mitosis A）相关激酶的双等位基因突变（c.805-1G>C; p. Ile269GlnfsTer8/c.1117dupA; p.Thr373AsnfsTer19）（c.29T>C; p.Ile10Thr/c.356A>G; p.His119Arg）。在双等位基因失活突变导致提前终止密码子的患者1中，NEK3的蛋白水平被消除。随后的转录组分析显示，NNMT（烟酰胺N-甲基转移酶）和SIRT2（sirtuin2）在体外人视网膜色素上皮（RPE）细胞中由NEK3敲低上调，这通过Western blot和免疫荧光与α-微管蛋白脱乙酰化相关。透射电子显微镜（TEM）分析进一步确定了患者1中纤毛超结构的缺陷。此外，核孔复合物（NPC）的内环成分，包括核孔蛋白（NUP）205、NUP188和NUP155，在NEK3沉默的细胞中显著下调。总之，本研究鉴定了NEK3的双等位基因突变，通过SIRT2介导的α-微管蛋白脱乙酰化和内环核孔蛋白的下调，使个体易患与纤毛相关的异常心脏左右模式。我们的研究表明，NEK3可能是人类纤毛病的候选基因[6]。

NEK3与癌症中13q14缺失的关联表明，染色体区域13q14在前列腺癌中经常缺失。NEK3是一种位于该区域的蛋白激酶相关基因。NEK3编码区的分析显示，在第9个外显子的末端腺嘌呤串中存在一个A插入/缺失多态性，其中两个等位基因分别显示7个或8个腺嘌呤。此外，还发现了一种缺乏整个第10个外显子的变体人类NEK3转录本，这是由于选择性剪接。A8等位基因的频率在前列腺癌样本中（p < 0.001）显著高于正常对照，表明肿瘤样本优先表达全长蛋白。相反，正常样本对A7等位基因的频率更高，优先表达较短的蛋白。为了测试这种关联是否是癌症中13q14改变的常见特征，分析了来自口腔、肺和肝细胞癌的细胞系。观察到NEK3 A插入/缺失多态性与13q14改变的癌症之间存在关联[7]。

NEK激酶家族成员在食管腺癌和Barrett's食管中的差异表达表明，食管腺癌（EAC）的发病率在过去四十年中迅速上升，使其成为美国和西方国家最常见的食管癌类型。NEK（Never in mitosis A（NIMA）相关激酶）基因家族是一组包含11个成员的丝氨酸/苏氨酸激酶。NEKs的异常表达最近被发现存在于各种人类癌症中，并在肿瘤发生、进展和耐药性中发挥着重要作用。然而，NEKs在EAC及其癌前状态（Barrett's食管，BE）中的表达尚未被研究。本研究首先使用生物信息学方法分析了TCGA和9个GEO数据库（总共10个数据库，其中8个包含EAC，6个包含BE）中NEKs在EAC和BE中的表达。发现NEK2（7/8）、NEK3（6/8）和NEK6（6/8）等多种NEK成员在EAC中与正常食管样本相比显著上调。相反，NEK1在EAC中下调。此外，这些NEKs的基因组改变在EAC中并不常见。使用qRT-PCR验证了上述发现，并使用Western blotting和免疫组化分析了EAC细胞系和原发EAC组织中的NEKs蛋白表达。数据表明，NEK2、NEK3和NEK7的频繁上调可能在EAC中发挥重要作用[8]。

NEK家族在透明细胞肾细胞癌中的预后价值和免疫浸润表明，透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是一种致命的泌尿生殖系统恶性肿瘤。NIMA相关激酶（NEK）家族成员被发现参与多种癌症的进展，并可能作为治疗相应疾病的靶基因。然而，NEK家族基因在ccRCC中的预后价值和免疫浸润水平尚不清楚。GSCA、TIMER和GEPIA数据库被用来检查NEK家族成员在ccRCC中的差异表达，Kaplan-Meier绘图器被用来分析预后。STRING数据库被用来构建蛋白质-蛋白质相互作用网络。此外，使用TIMER和TISIDB数据库探索了NEK家族基因与免疫细胞的关系。最后，使用定量实时PCR（qPCR）和免疫组化（IHC）进行实验验证。NEK2、NEK3、NEK5、NEK6和NEK11在ccRCC和正常组织中的转录水平存在显著差异。此外，NEK1、NEK2、NEK4、NEK8、NEK9和NEK10与ccRCC患者的临床病理分期显著相关。基于生存分析，NEK2、NEK3、NEK8和NEK10转录水平高，NEK1、NEK4、NEK5、NEK6、NEK7、NEK9和NEK11转录水平低的ccRCC患者生存时间较短。此外，观察到NEK家族成员与免疫细胞浸润、免疫细胞标记和免疫亚型之间存在显著相关性。这些结果表明，NEK家族成员在ccRCC中显著差异表达，NEK家族与预后和免疫浸润之间存在显著相关性。NEK家族成员可能作为ccRCC的治疗靶点和预后指标[9]。

NIMA相关激酶：小鼠nek3和nek4 cDNAs的分离和表征，以及nek1、nek2和nek3的染色体定位表明，Aspergillus NIMA激酶在有丝分裂的进入中起着关键作用，最近的证据表明哺乳动物NIMA相关激酶执行类似的功能。报告了小鼠nek3和nek4基因的克隆。小鼠nek3可能是部分测序的人nek3的同源物，而小鼠nek4 cDNA可能是人类STK2的同源物。Nek4在鼠和人之间高度保守，而Nek3的保守性稍低（激酶结构域分别为96.5%和88%的同一性）。Northern分析显示，nek3在分裂活性组织中优先表达，而nek4在睾丸中高度丰富。在发育中的睾丸生殖细胞中，原位分析表明nek1、2和4表现出不同的表达模式，表明它们具有重叠但非完全相同的生物学功能。使用小鼠重组近交系（BXD）的连锁分析将nek1定位在8号染色体上Cpe和D8Mit8之间的32cM处，nek2定位在1号染色体的远端区域，nek3定位在8号染色体的最着丝粒区域[10]。

综上所述，NEK3是一种重要的NIMA相关激酶，参与细胞内运输、细胞周期调节、信号传导和癌症进展等多种生物学过程。NEK3的过表达与多种癌症的不良预后相关，包括胃癌和ccRCC。NEK3还与纤毛病有关，其突变可能导致心脏左右模式异常。此外，NEK3的表达模式和组织特异性表明，它在不同细胞类型和生理状态下可能发挥不同的功能。NEK3的研究有助于深入理解NIMA相关激酶家族在细胞生物学和疾病发生中的重要作用，为开发新的治疗策略和预后指标提供理论基础。