Endou-KO 基因敲除小鼠

ENDOU基因编码一种内切核酸酶，它具有克服CHOP转录本5'-非翻译区（UTR）上游开放阅读框（uORF）陷阱的能力，从而在细胞内质网（ER）应激状态下允许CHOP下游编码序列的翻译[1]。ENDOU基因的转录调控机制一直是个谜。为了解决这个问题，研究人员克隆了人类ENDOU-1基因上游2.1 kb（-2055~+77 bp）的序列，并将其与报告基因萤光素酶（luc）cDNA融合。在pE2.1p转染的细胞和pE1.2p注射的斑马鱼胚胎中，pE2.1p驱动的启动子活性在应激诱导剂的作用下显著上调。通过比较pE2.1p和-1125~+77（pE1.2p）片段驱动的luc活性，研究人员发现位于-2055~-1125片段中的顺式元件可能在ENDOU-1在ER应激状态下的上调中发挥关键作用。由于生物信息学分析预测了在-1850~-1250区域聚集了许多顺式元件，研究人员进一步拆解了该区域，以生成基于pE2.1p的缺失-1850~-1750、-1749~-1650、-1649~-1486、-1485~-1350或-1350~-1250片段的衍生品。这五个内部缺失质粒驱动的启动子活性定量结果表明，在-1649~-1486区域存在一个抑制子结合元件，而在-1350~-1250区域存在一个激活子结合元件。由于由-1649~-1486驱动的luc活性在正常和应激条件之间没有显著差异，因此研究人员提出，应激诱导的激活子在-1350~-1250片段上的结合对人类ENDOU-1在ER应激下的表达增加做出了主要贡献[1]。

ENDOU基因家族属于真核生物内切核酸酶家族，具有与XendoU结构域高序列同源性。一些ENDOU蛋白的酶活性及其三维结构已经被报道。然而，它们的分子结构及其在胚胎发生过程中的基因表达模式仍有待阐明。因此，研究人员以斑马鱼（Danio rerio）endouC为模型，研究不同发育阶段的分子结构和基因表达动态。斑马鱼endouC cDNA包含930个碱基对，编码309个氨基酸残基，与人类、小鼠、鸡和青蛙的同源性分别为27%、27%、27%和25%。系统发育树显示，斑马鱼EndouA与脊椎动物Endou组聚集在一起，而斑马鱼EndouB和EndouC则属于一个独特的单系群。此外，endouC转录本在一细胞胚胎中被检测到，这表明它是一种母体基因。虽然endouC转录本在早期发育阶段仅弱表达，但其表达在受精后18到48小时内胚胎中显著增加，然后在72小时后下降。最后，在早期胚胎发生过程中，endouC在整个胚胎中普遍表达，但其表达在24到96小时受精后富集于大脑、眼睛和鳍芽中[2]。

宫颈癌是全球公共卫生负担。鉴于它在可能治愈的阶段的通常无症状，开发临床准确的测试对于早期检测和个体风险分层至关重要。本研究对10个宫颈癌队列的转录组进行了综合元分析，旨在识别与宫颈上皮恶性转化相关的生物标志物，并建立其临床适用性。在排名靠前的差异表达基因中，研究人员选择了 flap结构特异性内切酶1（FEN1）和聚（U）特异性内切核酸酶（ENDOU）进行进一步验证，并使用免疫组化染色微阵列评估其临床适用性，该微阵列包含110个组织核心，以p16和Ki67染色作为比较测试。结果表明，FEN1表达在65%的肿瘤标本中显著上调（P=0.0001），在非肿瘤组织中无表达。此外，其表达与肿瘤样本中的Ki67染色显著相关（P<0.0001），但与p16表达或人乳头瘤病毒16/18型、患者年龄、肿瘤分级或分期无关。FEN1染色敏感性低于p16（69.3% vs. 96.8%）和Ki67（69.3% vs. 76.3%）；然而，其特异性与p16相同，高于Ki67（100% vs. 71.4%）。ENDOU染色与微阵列结果一致，在肿瘤中的阳性率为1%，在非肿瘤组织中的阳性率为40%。对FEN1过表达宫颈癌的基因集富集分析表明，其与生长因子信号增强、免疫反应抑制和细胞外基质重塑相关，而ENDOU表达低下的肿瘤表现出上皮发育和分化过程的抑制。总的来说，本研究的结果表明，综合元分析方法可以识别与宫颈癌发生相关的相关生物标志物。因此，FEN1和ENDOU可能是鳞状细胞宫颈癌的有用诊断生物标志物。然而，需要进一步的研究来确定它们在大规模患者队列中的诊断性能，并验证这里提出的结果[3]。

为了确定调节外周B细胞存活和自身抗原（Ags）耐受性的分子，研究人员在经历激活诱导细胞死亡（AICD）的CD22缺陷C57BL/6（CD22-/-[B6]）小鼠B细胞中进行基因修饰筛选。同样，Ig(Tg)鸡卵溶菌酶（HEL）转基因小鼠中的溶菌酶自身抗原特异性B细胞居住在脾脏中，但在遇到自身抗原后会发生AICD。这个基因修饰筛选确定了EndoU，一个古老的单链RNA结合蛋白，是两种模型中外周B细胞存活的主要调节因子。EndoU基因破坏可防止AICD并使c-Myc表达正常化。这些发现揭示了EndoU是一个关键的调节因子，它控制着一个意想不到的、新的RNA依赖性途径，该途径调节外周B细胞的存活和对自身抗原的响应，可能有助于外周B细胞的耐受性[4]。

核糖核酸酶A家族的蛋白质在生物化学和生物物理学方面得到了很好的研究，但其进化起源尚不清楚，因为在脊椎动物之外尚未报道与该家族同源的序列。最近，来自细菌多形性毒素的核糖核酸酶结构域的三维结构与脊椎动物核糖核酸酶A的结构非常相似。两种结构之间缺乏序列相似性促使人们对细菌和脊椎动物核糖核酸酶A样酶的趋同进化进行推测。研究人员表明，具有已知或预测的核糖核酸酶A样折叠的细菌和同源的古菌多形性毒素核糖核酸酶是存在于所有细胞生命领域和病毒中的ENDOU家族核糖核酸酶的远亲。研究人员还检测到海胆Mesocentrotus franciscanus转录组组装中存在脊椎动物核糖核酸酶A的直系同源物。这些观察结果表明，原核生物核糖核酸酶A样和普遍存在的ENDOU样核糖核酸酶具有共同的祖先，并提出了动物核糖核酸酶A起源的更合理的场景，它可能是在后口动物谱系中通过ENDOU基因副本的广泛修饰或更可能通过原核生物免疫介导核糖核酸酶基因的水平获得而出现的[5]。

冠状病毒内切核酸酶（EndoU）编码在非结构蛋白（nsp）15的序列中，最初被鉴定为病毒复制复合物的成分。生物化学和结构研究揭示了nsp15/EndoU的酶活性，它被认为对Nidovirales病毒的独特复制周期至关重要。然而，nsp15在冠状病毒复制中的作用一直是个谜，因为EndoU缺陷的冠状病毒在成纤维细胞中是可存活的，并且复制到接近野生型病毒水平。最近的研究揭示了nsp15/EndoU功能的一个突破，这些研究显示，EndoU介导了病毒双链RNA被宿主传感器的识别的逃避。这种对nsp15/EndoU功能的新发现为研究病毒EndoU如何促进发病机制以及如何利用该酶进行针对致病冠状病毒的治疗和疫苗设计提供了新的机会[6]。

上游开放阅读框（uORFs）已知会负向影响下游ORF的翻译。然而，涉及缓解这种抑制的调节蛋白却很少被描述。细胞应激下，eIF2α磷酸化导致全球蛋白质合成的抑制，而特定因子（如CHOP）的翻译被诱导。研究人员分析了人类CHOP转录本中的一个105nt抑制性uORF，并发现过表达斑马鱼或人类ENDOU聚（U）内切核酸酶（Endouc或ENDOU-1）即使在无应激的情况下也能增加CHOP mRNA的翻译。研究人员还发现Endouc/ENDOU-1结合并切割huORFchop转录本在位置80G-81U，从而在不依赖于磷酸化eIF2α的情况下诱导CHOP的翻译。然而，ENDOU和磷酸化eIF2α对于CHOP mRNA的最大翻译仍然是必需的。ENDOU水平升高将huORFchop报告基因以及内源CHOP转录本从单体转移到多体，表明翻译增加。此外，研究人员发现，未加帽的截断huORFchop-69-105nt转录本包含一个内部核糖体进入位点（IRES），促进切割转录本的翻译。因此，研究人员提出了一个模型，其中ENDOU介导的转录本切割正调节CHOP翻译，导致应激下CHOP蛋白水平升高。具体来说，CHOP转录本切割改变了huORFchop的配置，从而释放其抑制，并允许停滞的核糖体恢复下游ORF的翻译[7]。

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是全球范围内发病率和死亡率都很高的主要癌症。该研究的目的是通过综合生物信息学分析确定具有临床意义的基因，并研究其在HNSCC中的作用。研究人员下载并分析了GSE6631和GSE107591的两个基因表达数据集，以筛选HNSCC中的差异表达基因（DEGs）。通过基因本体和KEGG通路富集分析对共同的DEGs进行了功能分析。使用STRING数据库和Cytoscape构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。ENDOU在FaDu和Cal-27细胞系中过表达，并使用MTT、划痕和Transwell实验评估了细胞增殖和迁移能力。使用TCGA HNSCC数据集验证了ENDOU的预后性能及其与肿瘤浸润物的表达相关性。在两个数据集中，98个基因具有共同的差异表达，其核心功能如细胞外基质组织显著富集。15个基因表现出预后意义，COBL和ENDOU在HNSCC中作为独立的生存标记。体外ENDOU过表达抑制了FaDu和Cal-27细胞的增殖和迁移，表明其在HNSCC进展中的肿瘤抑制作用。GSEA分析表明ENDOU下游通路如DNA复制、错配修复、细胞周期和IL-17信号通路。ENDOU在HNSCC中的表达相对较低，尤其是在HPV阳性的HNSCC样本中。最后，ENDOU与肿瘤纯度和肿瘤浸润巨噬细胞呈负相关，尤其是M2巨噬细胞。本研究确定了ENDOU是HNSCC进展中的生物标志物，具有重要的预后意义[8]。

当脂质代谢紊乱与衰老和与衰老相关的疾病相关联时，衰老过程中脂质代谢的调节机制尚不清楚。在这里，研究人员表征了果蝇内切核酸酶CG2145，它是哺乳动物EndoU的同源物，命名为与衰老相关的脂质调节剂（Arlr），作为衰老过程中脂质稳态的调节剂。在成年脂肪组织中，Arlr对于维持随着年龄增长而衰老的脂滴（LDs）中的脂质储存是必需的，这种表型可以通过高脂肪或高葡萄糖饮食来挽救。有趣的是，arlr突变脂肪组织的RNA-seq和RIP-seq表明，Arlr通过降解脂解基因的mRNA来影响脂质代谢 - 这一模型进一步得到观察到的结果的支持，即敲低Lsd-1、regucalcin、yip2或CG5162（编码参与脂解的基因）挽救了arlr突变体的LD缺陷。此外，研究人员表征了DendoU作为Arlr的功能性旁系同源物，并表明人类ENDOU可以挽救arlr突变体。总的来说，本研究揭示了ENDOU样内切核酸酶作为脂解的负调节因子[9]。

在一项先前的研究中，研究人员在人类基因组中鉴定了一个117个碱基的SARS-CoV-2序列，与人类基因组的94.6%同源。该序列位于1p染色体上的netrin G1（NTNG1）基因的内含子区域。该序列与SARS-CoV-2 Orf1b基因中的非结构蛋白14（NSP14，一种外切核酸酶）和NSP15（一种内切核酸酶）中的序列相匹配。在当前研究中，研究人员将人类基因组与其他病毒基因组进行了比较，以确定在后者中发现的某些人类序列的特征。大多数病毒具有人类序列，但它们很短。甲型肝炎病毒和圣路易斯脑炎病毒具有比117个碱基的SARS-CoV-2序列更长的人类序列，但它们位于人类基因组的非编码区域。SARS-CoV-2序列是唯一在人类基因（NTNG1）中发现的较长的序列。相关的冠状病毒SARS-CoV在3号染色体上有一个41BP的人类序列，它不是人类基因的一部分，而MERS没有人类序列。117个碱基的SARS-CoV-2人类序列相对接近病毒刺突序列，仅与NSP16（一个904个碱基的序列）隔开。SARS-CoV-2感染机制是病毒刺突蛋白与膜结合形式的血管紧张素转换酶2（ACE2）结合，并通过宿主细胞内化该复合物。对于这里观察到的NSP14和NSP15 SARS-CoV-2序列或它们可能如何与传染性相关，研究人员没有解释。需要进一步的研究[10]。

ENDOU基因编码一种内切核酸酶，它在细胞应激、病毒复制和脂质代谢等生物学过程中发挥重要作用。ENDOU基因的表达受顺式元件的调控，这些元件在应激状态下被激活，导致ENDOU基因的上调。ENDOU蛋白通过克服uORF陷阱，促进CHOP等应激相关蛋白的翻译。ENDOU蛋白在宫颈癌和头颈部鳞状细胞癌中表达下调，表明其可能具有肿瘤抑制功能。ENDOU蛋白在果蝇脂肪组织中维持脂质稳态，通过下调脂解基因的表达来防止脂质代谢紊乱。ENDOU基因在人类基因组中的存在可能与其在病毒复制中的作用有关。ENDOU基因的研究为理解其在生物学过程和疾病发生中的作用提供了新的见解，并为开发新的治疗策略提供了潜在的靶点。