Creld2-KO 基因敲除小鼠

Creld2，即富含半胱氨酸的蛋白质，具有表皮生长因子（EGF）样结构域2，是一种在哺乳动物中发现的蛋白质。Creld2是CRELD家族的第二个成员，该家族的第一个成员是CRELD1，也被称为AVSD2基因，其突变与心脏房室间隔缺损（AVSD）有关。Creld2在发育过程中广泛表达，并在成熟组织中持续表达。最近的研究表明，Creld2的一个特定异构体（CreLD2β）是α4β2烟碱型乙酰胆碱受体表达的调节因子，这表明CRELD家族在发育事件和后续细胞功能中具有广泛多样的生物学作用[1]。

Creld2基因通过荧光原位杂交（FISH）技术被定位在22q13，而不是之前报道的22p13。比较基因组分析显示，上游序列中存在一个高度保守的区域，具有启动子区域的标志性特征。功能分析表明，该区域具有启动子活性。与Creld2的广泛表达一致，该区域富含GC且缺乏TATA框。总体而言，Creld2在成人内分泌组织中的表达水平最高。然而，Creld2的剪接变体广泛存在，大多数正常胎儿和成人组织都表达了几种已确认的剪接变体。这些剪接变体编码5种不同的Creld2异构体，其组成存在显著差异，表明Creld2的功能是多样化的，目前尚不完全清楚[1]。

Creld2是一种新的内质网（ER）应激诱导基因。在Neuro2a细胞中，通过微阵列分析，Creld2被鉴定为Thapsigargin（Tg）诱导的基因。Creld2 mRNA也被证明是由ER应激诱导剂tunicamycin和brefeldin A立即诱导的。在Creld2启动子的基因组序列中，发现了一个典型的ER应激反应元件（ERSE），该元件在多种物种中高度保守。通过使用荧光素酶报告分析，证明了小鼠Creld2中的ERSE是功能性的，并且对Tg和ATF6过表达有反应。小鼠Creld2启动子中ATF6或NF-Y结合位点的每个突变都显著降低了基础活性和对ER应激刺激的反应性。研究表明，Creld2可能是调节ER应激相关疾病发生和进展的新介质[2]。

Creld2是一种新型的钙释放和钙调神经磷酸酶-NFAT信号通路的调节因子，在破骨细胞分化过程中发挥作用。Creld2是一种ER定位的伴侣蛋白，具有钙结合特性。Creld2是一种ER应激调节基因，已证实参与骨骼发育不良的发病机制，并在软骨细胞和成骨细胞的分化中发挥重要作用。尽管Creld2在骨骼发育和骨形成中具有既定作用，但其目前在破骨细胞中的作用尚不清楚。研究表明，Creld2在破骨细胞分化早期通过转运转化生长因子β1（TGF-β1）发挥新作用，这导致Nfat2的表达上调，Nfat2是破骨细胞分化的主要调节因子。尽管有这一发现，但研究发现，Creld2的过表达会损害破骨细胞的分化，这是由于钙依赖性磷酸酶calcineurin的活性降低。这反过来又导致核因子活化T细胞1（NFATc1）的去磷酸化受阻，从而阻止其核定位和作为促破骨生成转录因子的激活。结果表明，Creld2在破骨细胞分化过程中调节钙通量，具有重要的生理意义，对骨重塑和骨骼疾病的发病机制有重要影响[3]。

Creld2和天冬酰胺连接糖基化12同源物（ALG12）基因作为双向（头对头）基因对排列，并由一个共同的启动子调控。这个短的基因间区域包含一个ER应激反应元件（ERSE）序列，并在人类、大鼠和小鼠基因组中高度保守。微阵列分析显示，在Neuro2a细胞中，Tg作为ER应激诱导剂处理时，Creld2和ALG12 mRNA的表达以时间依赖性方式诱导。其他ER应激诱导剂tunicamycin和brefeldin A也增加了Neuro2a细胞中这两种mRNA的表达。使用双向报告构建体的变体，测试了基因间区域中的ERSE基序和其他调节位点在Creld2和ALG12基因转录调控中的可能作用。关于Creld2-ALG12基因对的启动子活性，整个基因间区域对Tg几乎没有反应，而含有ERSE基序的Creld2启动子构建体对Tg表现出显著的响应性。ALG12基因中的ERSE基序在相反方向上对Tg的反应性较低。然而，这个基序与每个转录起始位点之间的方向和距离对这两个基因对Tg治疗的反应性没有影响。此外，在基因间区域发现了三个潜在的序列，它们拮抗ERSE介导的转录激活。结果表明，小鼠Creld2和ALG12基因排列为独特的双向基因对，并且它们可能通过ATF6和多个其他转录因子的相互作用来调节[4]。

Creld2是一种重要的ER应激诱导蛋白，主要由ATF6调控。在Neuro2a细胞中，CRELD2蛋白在心脏和骨骼肌中的表达可以忽略不计。在Tm处理后，与生长停滞和DNA损伤诱导基因153（GADD153）的快速诱导相比，Neuro2a细胞中的CRELD2表达在晚期阶段被诱导。另一方面，另一种ER应激诱导剂Thapsigargin增加了Neuro2a细胞中内源性Creld2的分泌。研究发现，CRELD2不仅与自身相互作用，而且与Neuro2a细胞中的ER定位蛋白相互作用。此外，研究发现，CRELD2缺陷的Neuro2a细胞对Tm处理的反应性降低，表明Creld2缺陷的Neuro2a细胞对Tm刺激更加敏感。这些发现提供了Creld2的新的分子特征，其进一步的特征描述将为我们理解ER稳态和ER应激诱导的细胞功能障碍提供新的见解[5]。

Creld2表达受多种因素通过转录和转录后机制调节。通过构建各种荧光素酶报告器，发现Creld2启动子中一个保守的ATF6结合元件在ATF6短暂过表达时被激活。研究发现，ATF6缺陷显著抑制了Tm诱导的非糖基化CRELD2的表达。这种减少反映了CRELD2转录水平的降低。另一方面，小鼠Creld2启动子中一个假定的ATF4结合位点对Tm刺激没有反应，但ATF4的丧失导致CRELD2 mRNA和蛋白表达减少，伴随着Tm诱导的ATF6表达的降低。相反，GADD34（ATF4下游因子）的短暂抑制抑制了Tm诱导的CRELD2蛋白表达，而没有降低ATF6蛋白表达。此外，通过生成各种CRELD2和NHK（一种已知的ERAD底物，即α1-抗胰蛋白酶截短突变体）构建体，研究了CRELD2与NHK的结合。当Creld2的N端CXXC基序中的半胱氨酸被丙氨酸取代时，观察到这些蛋白的共免疫沉淀。发现这两种蛋白之间的相互作用是二硫键非依赖性的。这些发现表明，Creld2的表达受多种因素通过转录和转录后机制调节。此外，Creld2的N端结构，包括CXXC基序，可能在目标蛋白的结合中发挥作用。未来，识别和表征与Creld2相互作用的因子将有助于理解各种ER应激条件下的蛋白质稳态[6]。

Creld2是内质网蛋白，具有钙结合特性。研究表明，Creld2与α1-抗胰蛋白酶截短突变体NHK结合，但与COMP（另一个已知的ERAD底物）不结合。这表明Creld2可能在ER相关蛋白降解（ERAD）过程中具有选择性。此外，Creld2的CXXC基序对于与NHK的结合是必要的，因为当CXXC基序中的半胱氨酸被丙氨酸取代时，结合消失。这表明Creld2的N端结构在ERAD中的作用中可能发挥重要作用[6]。

Creld2是一种新型的ER应激诱导蛋白，与多种生物学过程相关。Creld2在心脏房室间隔缺损、ER应激、破骨细胞分化、基因调控、钙释放和信号传导等方面发挥作用。Creld2的表达受多种因素调控，包括ATF6、ATF4和GADD34。Creld2的N端结构可能在目标蛋白的结合中发挥作用。Creld2的研究有助于深入理解ER应激的分子机制和生物学功能，为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。