Crtam-KO 基因敲除小鼠

Crtam（Class-I MHC-restricted T-cell associated molecule），即I类MHC限制性T细胞相关分子，属于Nectin-like粘附分子家族。Crtam在自然杀伤细胞（NK）、自然杀伤T细胞（NKT）和CD8+ T细胞中迅速诱导表达。Crtam与其配体Nectin-like 2的结合，可以增强活化CD8+ T淋巴细胞分泌干扰素-γ（IFN-γ）[1]。通过生物信息学分析人类Crtam基因上游区域，发现了一些潜在的顺式作用元件，这些元件可能对Crtam基因的转录至关重要。研究发现，Crtam基因启动子区存在一个AP-1结合位点，位于ATG翻译起始密码子上游1.4kb处，是活化但非静息状态的人类CD8+ T细胞中Crtam表达的关键调控元件。Crtam的表达受到JNK-AP-1信号通路的驱动，使用JNK抑制剂SP600125处理后，活化CD8+ T细胞中Crtam的表达降低。AP-1作为Crtam基因的正向转录调控因子，其发现具有重要意义，因为Crtam最近被证明在IFN-γ和IL-17的产生以及T细胞增殖中发挥作用[1]。

在免疫调节型三阴性乳腺癌（TNBC）中，Crtam的表达升高与患者的总生存期和无复发生存期改善相关。基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析表明，Crtam与免疫反应和免疫系统过程密切相关。Crtam过表达诱导了STAT1的磷酸化和干扰素刺激基因的上调。Crtam增强肿瘤相关免疫细胞的浸润，尤其是CD8+ T细胞，这可能与Crtam过表达导致的主要组织相容性复合体I类分子表达增加有关。这些结果提示Crtam可能是预测TNBC患者免疫治疗效果的潜在生物标志物[2]。

ZEB1（zinc finger E-box-binding protein）是一种同源框/锌指转录因子，在T细胞中负调控Crtam的表达。ZEB1过表达抑制Crtam启动子活性，降低人T细胞中Crtam的内源水平。当Crtam启动子中的E-box样元件发生突变时，ZEB1介导的转录抑制被消除。ZEB1在非刺激和刺激的T细胞中均作为Crtam基因的转录抑制因子，从而调节适应性免疫反应[3]。

Crtam决定CD4+细胞毒性T淋巴细胞（CD4+ CTL）谱系。在活化状态下表达Crtam的CD4+ T细胞具有CD4+和CD8+ T细胞的双重特征。这些Crtam+ CD4+ T细胞分泌IFN-γ，表达与细胞毒性相关的基因，如Eomesodermin（Eomes）、颗粒酶B和穿孔素，并表现出细胞毒性功能。Crtam的过表达可以诱导T细胞产生IFN-γ，表达细胞毒性相关基因，并表现出细胞毒性活性。CD4+ CTL的诱导和IFN-γ的产生需要Crtam介导的细胞内信号传导。Crtam+ T细胞迁移到黏膜组织和炎症部位，并分化为CD4+ CTL，通过IFN-γ的分泌和细胞毒性活性，根据不同情况介导对感染的保护作用以及炎症反应的诱导[4]。

Nectin和Nectin-like（Necl）是表达于各种肿瘤的细胞粘附分子，它们在肿瘤抑制或致癌功能中发挥作用，因此被用作组织学或血清学癌症标志物。Necl-2在肺 carcinoma 中基因失活，但在白血病中过表达。DNAM-1和CRTAM是免疫细胞中的新兴NK受体，它们与Nectin和Necl相互作用。DNAM-1是Necl-5的配体，参与肿瘤免疫监视，促进Necl-5表达肿瘤细胞的裂解。CRTAM是Necl-2的配体，仅在有淋巴细胞活化的情况下表达。CRTAM与Necl-2的相互作用根据淋巴细胞类型的不同，具有相反的效果。对于NK或CD8+ T细胞，它促进细胞毒性和IFNγ的分泌，有利于免疫监视。相比之下，CRTAM/Necl-2的相互作用会触发活化的TVg9Vd2 γδ T细胞的死亡，有利于免疫逃逸。Nectin和Necl介导的相互作用似乎在肿瘤逃逸和抗肿瘤反应之间的微妙平衡中起着重要作用[5]。

在急性淋巴细胞白血病（ALL）的骨髓中，出现具有抑制特性的CRTAM+ NK细胞。由于儿童恶性肿瘤的发病率和死亡率不断增加，急性淋巴细胞白血病被认为是全球卫生的重点。控制恶性克隆的出现和随后正常-白血病造血细胞的竞争需要抗肿瘤监测机制。研究癌症免疫监视的先天细胞可能对于理解导致疾病进展或复发的机制以及通过正常对照来取代白血病造血至关重要。通过研究造血谱系分化途径中激活分子I类限制性T细胞相关分子（CRTAM）的表达，确定了共表达CD34、CD56/CD3/CD19和CRTAM的淋巴系祖细胞群，这些细胞群在显示nectin-like-2配体的专门区域中最早出现激活。值得注意的是，ALL患者的骨髓中富含预先活化的CD56high NK细胞，这些细胞表达CRTAM，并具有耗竭样表型和在体外产生IL-10和TGF-β的功能能力。这些发现首次表明，ALL的肿瘤微环境通过CRTAM/Necl-2的相互作用直接导致NK细胞功能的耗竭，并且耗竭样NK细胞可能通过促进恶性肿瘤的进展来损害抗肿瘤反应。ALL骨髓中这种独特的抑制性NK细胞群的表型和功能特征对于ALL的病理生物学和靶向策略的发展具有重要意义[6]。

为了研究Crtam的免疫球蛋白结构域，构建了表达Crtam IgV-IgC结构域、IgV和IgC结构域的原核表达系统。这些蛋白仅在包含茎部区域的情况下才能在可溶性部分中成功纯化。重组Crtam识别其配体nectin-like 2。还发现Crtam的IgC结构域被抗-hCRTAM单克隆抗体C8以0.62 nM的亲和力识别。结果表明，Crtam的茎部区域为Ig结构域的表达提供了可溶性[7]。

Crtam是类风湿性关节炎（RA）的潜在治疗和诊断靶点。RA是一种常见的慢性关节疾病。然而，由于RA患者之间的异质性，目前还没有可靠的诊断和治疗生物标志物。通过分析RA相关的基因表达数据集和免疫成分差异，发现Crtam是RA的潜在治疗和诊断靶点[8]。

单细胞转录组学和靶向基因组分析揭示了Crtam和PLCB1是克罗恩病（CD）患者对抗肿瘤坏死因子α（TNFα）治疗反应的新型中心基因。缺乏对TNFα生物制品反应的可靠生物标志物阻碍了CD患者的个性化治疗。本研究旨在通过单细胞RNA测序和一种创新方法，揭示可能被治疗或炎症掩盖的PBMCs基因表达信号，以改变抗TNFα生物标志物的发现方式。结果表明，PLCB1在CD4+ T细胞中，CRTAM在双阴性T细胞中，在整个分析过程中均达到严格的统计学阈值。此外，评估证实了这两个基因在抗TNFα治疗反应中的因果推断[9]。

鸡Crtam与nectin-like 2配体结合，并在CD8+ αβ和γδ T淋巴细胞上以不同的动力学上调。在寻找鸡基因组中的免疫调节受体过程中，通过整体同源性和几个保守的序列特征，鉴定了先前克隆的鸡序列为Crtam同源物。为了进一步表征，构建了Crtam特异性单克隆抗体。在新鲜分离的细胞制备物中，从胸腺、法氏囊、盲肠扁桃体、脾脏、血液和肠道中均未检测到染色。用重组IL-2活化脾细胞，在2小时内约30%的细胞中快速上调CRTAM的表达。这些CRTAM+细胞被鉴定为CD8+ γδ T淋巴细胞。相比之下，用IL-2刺激外周血淋巴细胞（PBL），即使在48小时的刺激期内，也无法刺激CRTAM的表达。作为第二种激活方式，使用抗αβ-TCR交联T细胞受体（TCR）导致CRTAM在PBL和脾细胞上表达。尽管脾细胞的刺激是用抗αβ-TCR进行的，但在2小时后，CRTAM的表达主要局限于CD8+ γδ T淋巴细胞。然而，在PBL中，较长时间的TCR刺激导致CRTAM表达在48小时后达到最大水平。有趣的是，尽管脾细胞的刺激是用抗αβ-TCR进行的，但2小时后CRTAM的表达主要局限于CD8+ γδ T淋巴细胞，然而，在PBL中，较长时间的TCR刺激导致CRTAM表达在48小时后达到最大水平。为了表征潜在的配体，克隆并表达了鸡Necl-2，它是nectin和nectin-like家族的成员，与哺乳动物同源物高度同源。三种独立的检测方法，包括报告基因检测、用Crtam-Ig融合蛋白染色和细胞结合检测，证实了Crtam与Necl-2的相互作用，这种相互作用可以被可溶性Crtam-Ig融合蛋白或Crtam特异性单克隆抗体阻断。结果表明，鸡Crtam是CD8+ T细胞上的早期激活抗原，与Necl-2结合，在αβ和γδ T淋巴细胞上以不同的动力学上调[10]。

综上所述，Crtam在T细胞发育、增殖、活化、细胞毒性功能和免疫调节中发挥着重要作用。Crtam的表达受到AP-1和ZEB1的调控，与干扰素信号通路和免疫反应密切相关。Crtam在多种疾病中发挥重要作用，包括TNBC、RA和CD，可能是预测治疗效果的潜在生物标志物和治疗靶点。此外，Crtam在鸡CD8+ T淋巴细胞上的表达动力学与哺乳动物存在差异，提示Crtam在不同物种中的功能和调控机制可能有所不同。Crtam的研究有助于深入理解T细胞生物学和免疫调节机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。