Cdc34-KO 基因敲除小鼠

Cdc34是一种在酵母和哺乳动物细胞中发现的泛素结合酶（E2），它在细胞周期调控、DNA修复和蛋白质降解等细胞过程中发挥重要作用。Cdc34基因的突变会导致酵母细胞在G1到S期的过渡中发生缺陷。Cdc34编码的蛋白质含有295个氨基酸残基，与酵母RAD6基因编码的蛋白质具有序列相似性。RAD6基因参与多种细胞功能，包括DNA修复，并被证明编码泛素结合酶。Cdc34基因的产物在体外催化泛素与组蛋白H2A和H2B的共价连接，这表明Cdc34蛋白质是泛素结合酶家族中的另一个成员。Cdc34的细胞周期功能可能是由其产物的泛素结合活性介导的[1]。

酵母CDC34基因的产物可以自身泛素化形成多泛素链连接的蛋白质。当在大肠杆菌中表达时，Cdc34蛋白通过其硫酯连接的泛素转移到赖氨酸的分子内转移催化其自身的泛素化。在这个过程中，多个泛素组被添加到Cdc34，并且这些泛素组被发现主要排列成单一的Lys48特异性多泛素链。对Cdc34的Asn-Gly序列进行羟基胺依赖性切割分析表明，主要的泛素连接位点位于Cdc34的C端215-295个残基内。这个区域的4个赖氨酸残基（Lys273、Lys277、Lys293和Lys294）被单一代换为精氨酸或组合代换，以产生一组Cdc34突变体。对这些Cdc34突变体进行自身泛素化分析表明，多泛素链可以在这4个赖氨酸中的任何一个上形成，尽管大多数Cdc34共轭物包含一个单一的多泛素链。由于Lys48特异性多泛素链在蛋白质共轭物中的存在已知会靶向接受蛋白在泛素介导的蛋白水解途径中降解，因此，这些结果表明泛素结合活性在CDC34中的一个功能可能是用于其自身的降解[2]。

人类CDC34 cDNA可以功能性地替代酵母CDC34基因，并代表了一组酵母基因的哺乳动物同源基因，这些基因对于G1到S期的过渡是必需的。人类CDC34基因在多种细胞系中作为唯一物种表达，Southern印迹分析表明，这是一个在高等真核生物中高度保守的单个基因。人类基因位于19p13.3远端端粒区域，该区域定义了人类染色体19p和鼠染色体11之间的同源区域[3]。

Cdc34（细胞分裂周期34）泛素结合酶在促进真核细胞周期中G1-S期转变中起着重要作用，并在体内被磷酸化。在目前的研究中，我们调查了磷酸化是否调节Cdc34的功能。我们将芽殖酵母Cdc34（yCdc34；Ser207和Ser216）和人类Cdc34（hCdc34 Ser203、Ser222和Ser231）的体内磷酸化位点映射到酸性尾域中的丝氨酸残基上，该域对Cdc34的细胞周期功能至关重要。CK2（蛋白激酶CK2）在体外磷酸化yCdc34和hCdc34。CK2介导的磷酸化增加了yCdc34对酵母Sic1的泛素化活性，当在存在其同源SCFCdc4 E3连接酶的情况下进行测定时[其中SCF是S期激酶相关蛋白1/cullin/F-box]。同样，将yCdc34磷酸化位点突变到丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸残基改变了Cdc34-SCFCdc4介导的Sic1泛素化活性。当在不存在SCFCdc4的情况下测定yCdc34的泛素化活性时，也得到了类似的结果，这表明磷酸化调节Cdc34的内在催化活性。为了评估改变Cdc34活性的体内后果，将野生型yCdc34和磷酸化位点突变体引入S. cerevisiae cdc34缺失菌株中，并在G1期同步后监测细胞周期的进展。与体外泛素化活性增加一致，表达磷酸化位点突变体并具有更高催化活性的细胞表现出细胞周期进展加速和Sic1降解。这些研究表明，CK2介导的Cdc34在酸性尾域上的磷酸化刺激了Cdc34-SCFCdc4泛素化活性和细胞周期进展[4]。

为了确定Cdc34/SCF泛素化复合物的新功能，我们分析了cdc53-1和cdc34-2 Saccharomyces cerevisiae突变体的全基因组转录谱。这项分析揭示了几个基因家族的表达改变，包括参与调节细胞壁组织和生物合成的基因。这导致我们发现了Cdc34/SCF复合物在调节细胞壁完整性中的作用。支持这一点的是，cdc53-1和cdc34-2突变体表现出细胞壁完整性突变体的表型特征，例如对SDS的敏感性以及对渗透稳定剂的温度敏感性抑制。对这些突变体的检查显示，它们的Slt2磷酸化诱导缺陷，表明Pkc1-Slt2 MAPK信号传导缺陷。一致的是，Cdc34/SCF复合物编码基因与Pck1-Slt2 MAPK途径的关键成分之间存在合成遗传相互作用。进一步的分析表明，Cdc34/SCF突变体中活性Rho1的水平降低，表明这些缺陷源于Rho1 GTP酶的失调活性。通过操纵LRG1或SAC7 Rho1-GAPs来改变Rho1的活性会影响Cdc34/SCF突变体的生长。然而，值得注意的是，删除LRG1挽救了与Cdc34/SCF突变体相关的生长缺陷，而删除SAC7加剧了这些缺陷。鉴于这些GAPs在调节Rho1中的不同作用，这些观察结果表明协调Cdc34/SCF活性与特定的Rho1功能的重要性[5]。

在单个赖氨酸包含的Saccharomyces cerevisiae Cdc34突变蛋白的体外实验中，我们发现SCF介导的自身泛素化刺激仅限于通过分子间机制修饰的特定N端赖氨酸。与此形成鲜明对比的是，SCF通过分子内机制抑制Cdc34的C端赖氨酸的自身泛素化。与C端赖氨酸的自身泛素化不同，C端赖氨酸的自身泛素化没有功能后果，N端赖氨酸的自身泛素化抑制Cdc34。这种自身抑制机制在体外和体内的催化循环中起着非必需的作用，因为不含赖氨酸（K0）Cdc34（ΔC）在泛素化原型SCF（Cdc4）底物Sic1的体外实验中与Cdc34（ΔC）无法区分，并且在酵母中用（K0）cdc34（ΔC）或cdc34（ΔC）等位基因替换CDC34基因时没有细胞周期表型。我们讨论了这些发现对Cdc34与SCF功能机制的启示[6]。

综上所述，Cdc34是一种重要的泛素结合酶，在细胞周期调控、DNA修复和蛋白质降解等细胞过程中发挥重要作用。Cdc34的功能受到磷酸化和自身泛素化的调节。Cdc34与SCF复合物一起参与调节细胞壁完整性和细胞周期进展。Cdc34的失调与多种疾病的发生发展有关，包括肺癌。Cdc34的研究有助于深入理解泛素化途径的生物学功能和疾病发生机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略[7]。