Nkg7-KO 基因敲除小鼠

Nkg7基因编码一种在自然杀伤细胞（NK细胞）和T细胞中表达的细胞表面蛋白，属于免疫系统的关键成分。该基因定位于人类染色体19上，编码的蛋白在免疫应答中发挥重要作用。Nkg7基因的表达与多种免疫细胞的功能密切相关，包括细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞的激活，以及免疫细胞之间的相互作用。

在非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗中，新辅助化疗免疫疗法已被证明能够提高病理反应和生存率。然而，并非所有肿瘤都对治疗产生完全响应，这导致了疾病早期进展。为了预测这些事件，研究者们对肿瘤样本的基因表达谱进行了表征，以寻找新的生物标志物和肿瘤对治疗反应的机制。在一项研究中，研究者对接受新辅助化疗免疫疗法的NSCLC患者进行了肿瘤全RNA测序，并使用一个针对与免疫过程相关的395个基因的面板进行了分析。结果表明，与无响应肿瘤相比，完全病理响应（CPR）肿瘤在治疗前具有更强的免疫浸润，表现为IFNG、GZMB、NKG7和M1巨噬细胞水平的升高，这些指标对于预测CPR具有显著的ROC曲线下面积（>0.9）。此外，新辅助治疗在CPR肿瘤中具有更大的效果，表现为治疗后肿瘤标志物和IFNγ信号通路的减少。在治疗后无响应肿瘤样本中，AKT1、BST2、OAS3或CD8B等基因的更高表达，以及树突状细胞和中性粒细胞的更高比例，与手术后的复发相关。此外，治疗前PD-L1和肿瘤突变负荷水平较高的患者，在手术后免疫景观中表现出增殖标志物和I型干扰素信号分子的下调[1]。

Nkg7基因在多种细胞类型中表达，包括激活的T细胞和A-LAK细胞，以及正常人的外周血。Nkg7 mRNA在表达TCR γδ的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）克隆中高水平表达，并且在一些表达TCR αβ的CTL克隆中也表达（包括CD4+和CD8+），但在其他TCR αβ表达的CTL克隆以及代表B细胞、单核细胞和骨髓细胞的细胞系中不表达。Nkg7 mRNA不在正常人的脑、心脏或骨骼肌中表达。Southern杂交分析表明，Nkg7是一个定位于19号染色体的单拷贝基因。预测的Nkg7蛋白是一个I型跨膜蛋白，具有一个38个氨基酸的细胞外域和一个61个氨基酸的细胞质域[2]。

在小鼠中，Nkg7基因编码一个17 kDa的粒细胞膜蛋白，称为GMP-17。GMP-17与晶状体纤维细胞固有膜蛋白MP19在许多方面非常相似。两种蛋白都是跨膜蛋白，每个蛋白都具有4个跨膜环。GMP-17和MP19的氨基酸序列有34%的相同性，相似氨基酸有49%。小鼠Lim2基因的编码核苷酸序列与人LIM2基因的编码核苷酸序列有88%的相同性，氨基酸水平的相同性为92%。在两个基因的 immediate 5'-upstream 区域观察到几个高度保守的区域。由于MP19和GMP-17蛋白的相似性，有趣的是推测晶状体MP19和淋巴细胞相关的GMP-17可能起源于一个祖先基因，通过遗传漂变，导致两个在两个广泛分离的组织类型中具有相似功能的分离蛋白[3]。

在动脉粥样硬化中，一些调节性T（Treg）细胞转化为exTreg细胞。研究者通过将诱导性Treg和exTreg细胞系谱追踪小鼠（FoxP3eGFP-Cre-ERT2ROSA26CAG-fl-stop-fl-tdTomato）与动脉粥样硬化易感Apoe-/-小鼠杂交，对Treg细胞和exTreg细胞进行分离，并通过bulk RNA测序确定其转录组。通过比较小鼠Treg细胞和exTreg细胞之间的差异表达基因，并在人类单细胞RNA测序（scRNA-seq）面板中筛选这些基因，确定exTreg细胞特征基因为CST7、NKG7、GZMA、PRF1、TBX21和CCL4。将这些基因投射到人类scRNA-seq与CITE-seq数据上，确定了人类exTreg细胞为CD3+CD4+CD16+CD56+。bulk RNA-seq分析表明，人类exTreg细胞是具有炎症和细胞毒性特征的CD4+T细胞，与自然杀伤细胞和Treg细胞显著不同。T细胞受体-β的DNA测序显示exTreg细胞中Treg细胞CDR3序列的克隆扩增。细胞杀伤和CD107a脱颗粒实验表明人类exTreg细胞是细胞毒性CD4+T细胞[4]。

在1型糖尿病（T1DM）的胰岛免疫微环境中，Nkg7基因也发挥了重要作用。研究者使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，重点研究了C1QB和NKG7在T1DM胰岛免疫微环境中的作用机制。T1DM相关的scRNA-seq数据从GEO数据库下载，并进行了批次效应去除、聚类分析、细胞注释和富集分析。随后，T1DM相关的Bulk RNA-seq数据也被下载，并估计了浸润免疫细胞的丰度及其与免疫细胞标志基因表达的相关性。功能实验在构建的T1DM大鼠模型和培养的单核细胞和淋巴细胞中进行。结果表明，T1DM胰岛样本中存在大量高度可变的基因。T1DM胰岛衍生的细胞可能由14种细胞类型组成。巨噬细胞和T淋巴细胞是胰岛免疫微环境中的主要细胞。C1QB和NKG7可能是影响巨噬细胞和T淋巴细胞的基因。沉默C1QB抑制了单核细胞向巨噬细胞的分化，并减少了巨噬细胞的数量。沉默NKG7防止了T淋巴细胞的活化和增殖。体内数据证实，沉默C1QB和NKG7分别减少了T1DM大鼠胰岛中巨噬细胞和T淋巴细胞的数量，并减轻了胰岛β细胞的损伤。总体而言，C1QB和NKG7分别增加了巨噬细胞和T淋巴细胞的数量，导致胰岛β细胞损伤，并促进大鼠的T1DM[5]。

在COVID-19的治疗中，研究者使用血清蛋白质组和RNA测序技术，研究了鼻用抗CD3单克隆抗体（Foralumab）对COVID-19患者免疫反应的影响。在随机试验中，轻至中度COVID-19门诊患者接受鼻用Foralumab（100 μg/d）连续治疗10天，并与未接受Foralumab治疗的患者进行比较。结果显示，Foralumab治疗组中幼稚T细胞数量增加，而NGK7+效应T细胞减少。CCL5、IL32、CST7、GZMH、GZMB、GZMA、PRF1和CCL4基因在T细胞中的表达下调，CASP1在T细胞、单核细胞和B细胞中的表达也下调。除了效应特征的下调外，在具有已知效应功能的细胞类型中还观察到TGFB1基因表达的升高。此外，还发现Foralumab治疗组中GTP结合基因GIMAP7的表达增加。Rho/ROCK1，作为GTPases信号通路的下游，在Foralumab治疗组中下调。Foralumab治疗组COVID-19患者的TGFB1、GIMAP7和NKG7转录组变化也在健康志愿者、多发性硬化症（MS）患者和鼻用抗CD3治疗的小鼠中观察到。这些发现表明，鼻用Foralumab调节了COVID-19的炎症反应，为治疗该疾病提供了新的途径[6]。

在系统性红斑狼疮（SLE）中，研究者调查了T细胞基因的异常特征、可溶性共抑制受体（Co-IRs）/配体以及T细胞上Co-IRs的表达作为狼疮疾病参数的生物标志物的可能性。使用CD4+和CD8+ cDNA微阵列对SLE的非肾性和终末期肾病（ESRD）表型的T细胞进行比较转录组分析。比较T细胞上Co-IRs的表达和SLE表型的血清可溶性介质。结果显示，SLE患者中ESRD的CD4+和CD8+ T细胞同时下调了CD38、PLEK、干扰素-γ、CX3CR1、FGFBP2和SLCO4C1转录本，CD8 T细胞中下调了NKG7、FCRL6、GZMB/H、FcγRIII、ITGAM、Fas配体、TBX21、LYN、粒酶、CCL4L1、CMKLR1、HLA-DRβ、KIR2DL3和KLRD1转录本。通路富集和PPI网络分析表明，大多数差异表达基因（DEGs）与新型细胞毒性、抗原呈递和趋化因子-细胞迁移特征通路相关。CD8+ GZMK+ T细胞，包括CD161+黏膜相关恒定T（MAIT）细胞和CD161-与年龄相关的T（Taa）细胞以及CD161- GZMK+ GZMB+ T细胞可能解释了与ESRD相关的CD8+ T细胞中GZMK水平的升高。SLE患者CD4+ T细胞上TIGIT+、PD1+和CD127-细胞百分比更高，CD8 T细胞上TIM3+、TIGIT+、HLA-DR+细胞频率更高，CD127、CD160的平均荧光强度（MFI）表达更低。T细胞上的Co-IRs表达与可溶性PD-1、PDL-2和TIM3水平、SLE疾病活动度、临床表型和免疫疗法反应相关。功能障碍通路的特征定义了LN ESRD患者中一种独特的免疫模式。外周血T细胞上Co-IRs的表达水平和血清中可溶性PD1/PDL-2/TIM3水平可以作为评估临床参数和治疗效果的生物标志物[7]。

在肺鳞状细胞癌（LUSC）的治疗中，研究者发现B7H3在LUSC中高度表达，并开发了DAP12-CAR-T靶向B7H3。当与B7H3过表达的LUSC细胞共培养时，B7H3-DAP12-CAR-T表现出显著的细胞杀伤效果，并释放细胞因子，包括IFN-γ和IL-2。然而，LUSC细胞以竞争性方式消耗蛋氨酸（Met）导致Met缺乏。CAR-T在低Met浓度培养基中表现出细胞杀伤能力下降、细胞因子释放减少和中央记忆T表型减少，而耗竭标志物上调。此外，由于m5C修饰的减少，NKG7基因在低Met浓度下在CAR-T细胞中下调。NKG7过表达可以部分恢复低Met条件下CAR-T的细胞毒性。此外，在低Met浓度下，与SLC7A5敲低LUSC细胞共培养时，CAR-T的抗肿瘤疗效显著增强。总的来说，B7H3是LUSC的一个有前景的治疗靶点，B7H3-DAP12-CAR-T细胞对LUSC治疗很有前景。维持CAR-T中的Met水平可能有助于克服TME抑制，并提高其临床应用潜力[8]。

在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，研究者发现CD8+MAIT细胞的比例和CXCR6表达与抗PD-1免疫治疗的效果相关。研究者对接受抗PD-1治疗的转移性NSCLC患者进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）、流式细胞术和多重免疫荧光实验，以确定CD8+MAIT细胞的比例和特征。生存分析用于确定MAIT细胞比例和CXCR6表达对晚期NSCLC患者预后的影响。结果显示，在抗PD-1治疗之前，响应者来源的外周血单个核细胞（PBMCs）和肺组织中，活化和增殖的CD8+MAIT细胞的比例显著升高，并且细胞毒性相关基因的表达增强，包括CCL4、KLRG1、PRF1、NCR3、NKG7和KLRK1。响应者的外周血和肿瘤浸润的CD8+MAIT细胞显示出CXCR6表达的升高。类似地，响应者中CXCR6+CD8+MAIT细胞表现出细胞毒性相关基因表达的升高，如CST7、GNLY、KLRG1、NKG7和PRF1。外周血中CD8+MAIT细胞与CD8+T细胞的比例≥15.1%，CXCR6+CD8+MAIT细胞与CD8+MAIT细胞的比例≥35.9%的患者在接受免疫治疗后表现出更好的无进展生存期（PFS）。CD8+MAIT细胞在肺癌免疫治疗中的作用可能通过CXCL16-CXCR6轴介导的经典/非经典单核细胞发挥作用。CD8+MAIT细胞是NSCLC患者对抗PD-1治疗响应的潜在预测生物标志物。CD8+MAIT细胞与免疫治疗敏感性的相关性可能归因于CXCR6的高表达[9]。

在皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）中最常见的亚型——蕈样肉芽肿（MF）中，研究者使用单细胞RNA测序（scRNAseq）和T细胞受体（TCR）测序（scTCRseq）对12例患者的皮肤病变进行了综合分析。从9例患者中获得了足够数量的活T细胞，但由于诊断不清（共存的慢性淋巴细胞白血病或更正为固定的毒性药物反应），2例被排除。从剩余的患者中，研究者建立了18,630个T细胞的单细胞mRNA表达谱和相应的TCR库。TCR克隆性明确地确定了13,592个恶性T细胞。所有患者的反应性T细胞聚集在一起，而每个患者的恶性细胞形成独特的簇，表达与幼稚/记忆表型（如CD27、CCR7和IL7R）或细胞毒性T细胞（如GZMA、NKG7和GNLY）相关的基因。编码经典CTCL标志物的基因在所有簇中均未检测到，这表明mRNA表达与蛋白质表达之间没有线性相关。然而，研究者成功确定了区分反应性和恶性T细胞的独特基因特征：恶性细胞中角蛋白（KRT81、KRT86）、半乳糖凝集素（LGALS1、LGALS3）和S100基因（S100A4、S100A6）过表达。结合scRNAseq和scTCRseq不仅允许明确地识别MF细胞，而且还揭示了患者之间和患者内部的高度异质性，以及意外的功能表型。虽然mRNA和蛋白质丰度之间的相关性在已建立的MF标志物方面有限，但研究者能够确定一个单细胞基因表达特征，该特征区分了恶性和反应性T细胞[10]。

综上所述，Nkg7基因在免疫系统中发挥重要作用，其表达与多种免疫细胞的功能密切相关。Nkg7基因的表达水平与肿瘤对治疗的响应、炎症反应和免疫细胞的活性相关。此外，Nkg7基因在多种疾病中发挥作用，包括非小细胞肺癌、1型糖尿病、COVID-19和系统性红斑狼疮。Nkg7基因的研究有助于深入理解免疫系统的功能和疾病发生机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。