Rab1b-KO 基因敲除小鼠

Rab1b属于Rab-GTPase家族，是一类调节膜转运和信号转导系统的蛋白质，能够控制多种细胞活动，包括基因表达。Rab1b对内质网-高尔基体转运至关重要。尽管它在几乎所有组织中都有表达，但其mRNA水平在不同组织之间有所差异。研究发现，在HeLa细胞中，Rab1b水平的增加会导致高尔基体大小和基因表达的变化。例如，分析涉及膜转运的基因（如KDELR3、GM130）和原癌基因JUN表明，Rab1b的增加作为分子开关控制这些基因的转录水平表达，从而在蛋白质水平上产生影响。这些Rab1b依赖性的变化需要p38丝裂原活化蛋白激酶的活性和cAMP反应元件结合蛋白共识结合位点在目标启动子区域的作用[1]。此外，在分泌性甲状腺细胞系（FRTL5）中，Rab1b表达在促甲状腺激素（TSH）刺激下增加。而且，FRTL5细胞中Rab1b表达的变化会改变特定的TSH反应。这些结果表明，Rab1b水平的改变可以调节基因转录，并强烈表明Rab1b的增加对于引发分泌反应是必需的[1]。

在RUNX1杂合缺失患者中，Rab1b相关的大血小板内质网-高尔基体转运功能受损，影响了血管性血友病因子（vWF）。RUNX1杂合缺失患者存在血小板减少、血小板功能障碍以及α-颗粒和致密颗粒缺陷。血小板表达谱分析显示，RUNX1突变（c.969-323G>T）的患者RAB1B表达降低，RAB1B编码一种小G蛋白。RAB GTP酶调节囊泡转运，RAB1B在非造血细胞中参与内质网到高尔基体的转运，但在巨核细胞（MK）中的作用尚不清楚。研究发现，RAB1B是RUNX1的直接靶标，RUNX1结合到RAB1B启动子区域的RUNX1共识位点，其突变降低了启动子活性。RAB1B启动子活性和蛋白质表达在RUNX1 siRNA处理后受到抑制，而在RUNX1过表达时增强。这些结果表明，RAB1B是RUNX1的直接靶标，为患者血小板中RAB1B表达降低提供了一种机制。内质网到高尔基体的囊泡转运在RUNX1或RAB1B siRNA下调后受损，同时伴随高尔基体破坏。RUNX1下调的影响通过RAB1B重新组成得以逆转。血管性血友病因子（vWF）是一种由巨核细胞合成的α-颗粒蛋白，其转运在RUNX1或RAB1B下调后受损，并通过外源性RAB1B表达得以重建。RUNX1突变患者的血小板vWF水平降低。因此，在RUNX1下调时，由于RAB1B表达降低，内质网到高尔基体的转运，作为蛋白质转运到颗粒中的早期关键步骤，在巨核细胞中受损。受损的RAB1B介导的内质网到高尔基体转运导致了RUNX1杂合缺失中血小板α-颗粒缺陷[2]。

Rab1B在弓形虫生长和形态发生中起着重要作用。弓形虫编码了十几种Rab蛋白，它们是小型GTP酶超家族的一部分，并调节细胞内膜转运。研究发现，Rab1B的耗竭会导致严重的寄生虫生长和形态结构缺陷。为了理解这种差异，研究人员进行了整合转录组和代谢组分析。在研究中，使用四环素诱导的TATi/Ty-Rab1B寄生虫系在三个不同时间点（0、18和24小时）使用ATc处理。通过透射电子技术观察到了Rab1B耗竭导致的形态学变化。然后，进行了高通量转录组和非靶向代谢组分析，以分析Rab1B耗竭寄生虫中的RNA表达和代谢物变化。通过整合组学方法揭示了Rab1B在寄生虫中的基本特性。透射电子显微照片显示，Rab1B耗竭的寄生虫中内质膜严重紊乱。对转录组和代谢组的深入分析确定了在18小时和24小时诱导的诱导型寄生虫系中分别有2181和2374个差异表达基因（DEGs）和30和83个差异表达代谢物（DEMs）。这些DEGs包括与包含棒状体、微线体、内质网和高尔基体的关键细胞器相关的关键基因。qRT-PCR分析验证了一些由RNA-Seq鉴定出的关键DEGs，支持关键的囊泡调节因子Rab1B参与了多个寄生虫细胞器的发生。功能富集分析揭示了与中央碳代谢和脂质代谢相关的途径，如三羧酸循环、甘油磷脂代谢和脂肪酸生物合成和延长。主要DEMs和DEGs的相关性分析支持了Rab1B在脂肪酸（如肉豆蔻酸和油酸）生物合成中的作用，这与通过内吞作用在生物素中发挥的清除作用一致。Rab1B在寄生虫生长和形态发生中发挥了重要作用，这得到了复制试验和透射电子显微镜观察的支持。多组学分析为蛋白质耗竭对寄生虫的整体影响提供了详细的见解。这些分析强化了Rab1B在内吞过程中的作用，这对脂肪酸生物合成和三羧酸循环有影响[3]。

研究发现，蛋白异戊二烯化与内吞转运相关，并使用点击化学方法对异戊二烯化蛋白质组进行了表征。通过CRISPR/Cas9基因组编辑，有效地生成了23个异戊二烯化候选基因的功能筛选遗传修饰系。这鉴定了四个调节内吞GFP囊泡转运的蛋白质。在这四种蛋白质中，Rab1B和YKT6.1高度保守，但在真核生物中是非经典的内吞蛋白质。共聚焦成像分析显示，Rab1B和Ras主要定位于寄生虫中的顺-高尔基网络和内体样隔室。Rab1B的条件敲低导致分泌转运到棒状体泡的快速缺陷，表明关键的调节因子Rab1B具有转运交叉功能。进一步的实验证实了蛋白质异戊二烯化在调节这些蛋白质（即Rab1B和YKT6.1）在寄生虫中的稳定性/活性方面的关键作用。这些发现定义了内吞转运的分子基础，并揭示了Rab1B在弓形虫中膜转运的潜在交叉功能。这可能会扩展到其他相关的原生生物，包括疟原虫[4]。

在高度侵袭性和亲本乳腺癌细胞系中进行的定量蛋白质组学分析发现，RAB1B在高度侵袭性乳腺癌细胞中显著下调。RAB1B的下调也发现可以促进体外和体内TNBC细胞的增殖和迁移。机制上，RAB1B的缺失导致TGF-β受体1（TβR1）的表达升高，通过降低泛素化降解，增加磷酸化SMAD3和TGF-β诱导的上皮-间质转化（EMT）水平。此外，RAB1B的低表达与乳腺癌患者的预后较差相关。这些发现揭示了RAB1B通过调节TGF-β/SMAD信号通路在TNBC中起转移抑制因子作用，并且RAB1B可能作为TNBC患者预后的新生物标志物和对抗肿瘤治疗的反应[5]。

PITPNC1作为PI4P结合蛋白，增强了恶性肿瘤中的囊泡分泌能力。研究发现，PITPNC1作为大量人类乳腺癌中扩增的基因，在转移性乳腺癌、黑色素瘤和结肠癌中过表达。生化、分子和细胞生物学研究揭示了PITPNC1通过结合高尔基体驻留PI4P并将RAB1B定位于高尔基体来促进恶性肿瘤分泌。RAB1B定位于高尔基体允许GOLPH3的募集，这有助于高尔基体的延伸和增强的囊泡释放。PITPNC1介导的囊泡释放通过增加分泌侵袭性和血管生成性介质HTRA1、MMP1、FAM3C、PDGFA和ADAM10来驱动转移。这些发现建立了PITPNC1作为PI4P结合蛋白，增强了恶性肿瘤中的囊泡分泌能力[6]。

Rab1B与ATG9A囊泡相关，并调节自噬体的形成。ATG9是一种膜蛋白，对自噬至关重要，被认为是直接参与自噬体形成的早期步骤。酵母Atg9主要定位于小的囊泡（Atg9囊泡），而哺乳动物ATG9A据报道定位于顺-高尔基网络、内体隔室和其他未确定的膜结构。为了解析ATG9A包含的膜，研究人员检查了ATG9A的亚细胞定位，并进行了这些膜的免疫分离。在人培养细胞中，ATG9A-绿色荧光蛋白被观察到作为许多快速在细胞质中移动的点。这些细胞质膜被分离出来，发现它们是类似于酵母Atg9囊泡的小囊泡。通过ATG9A囊泡的蛋白质组学分析获得的蛋白质之一是Rab1，这是一种在内质网到高尔基体囊泡转运中至关重要的GTP酶。Rab1B敲低研究表明自噬受到抑制。在这些Rab1B耗竭的细胞中，ATG9A在自噬体形成位点的中间膜结构中积累。这些结果表明，Rab1B参与调节自噬体的适当发育[7]。

Rab1B的异戊二烯化受其效应结构域突变的损害。低分子量GTP结合蛋白由Rab基因家族编码，通过特定的法尼基转移酶（GGTase II）进行翻译后修饰，该酶催化法尼基异戊二烯与以下羧基末端序列基序中的半胱氨酸形成硫醚键：GGCC、CXC、CCSN。含有这些序列的短肽在体外是异戊二烯化的差底物，这表明Rab蛋白和GGTase II之间的相互作用需要远离羧基末端的结构域。为了开始定义这些结构域，研究人员在Rab1B基因中创建了缺失和点突变，并评估了突变翻译产物在网织红细胞裂解物中异戊二烯化的能力。氨基酸2-9的缺失减弱了Rab1B的异戊二烯化，但并未消除异戊二烯化，这表明氨基末端区域并非绝对需要与GGTase II相互作用。在氨基末端区域的更长缺失，可能破坏Rab1B的整体构象，完全阻止了异戊二烯化。预测位于氨基末端可变区域（Y5N）、β3链（Q60E）和环7（A110D）的Rab1B结构中的点突变并未降低异戊二烯化。然而，在效应结构域中的两个突变（I41N、D44N），该结构域似乎介导与刺激GTP水解或GDP解离的蛋白质的相互作用，几乎完全消除了Rab1B进行异戊二烯化的能力。这些发现表明，效应结构域在Rab蛋白的异戊二烯化中起着关键作用，要么作为prenyltransferase结合位点，要么通过促进与辅助蛋白质的相互作用，使Rab1B能够采取一种特定的鸟苷酸依赖性构象，这种构象被GGTase II所识别[8]。

Rab1B通过与小肿瘤坏死因子受体相关因子3（TRAF3）相互作用促进抗病毒先天免疫。先天免疫检测到病毒感染期间的病毒核酸激活了信号级联反应，诱导I型和III型IFN以及其他细胞因子，以产生抗病毒反应。该信号由模式识别受体启动，如RNA解旋酶视黄酸诱导基因I（RIG-I），它检测病毒RNA。这些传感器然后与适配蛋白线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）相互作用，MAVS招募其他信号蛋白，包括TNF受体相关因子3（TRAF3）和TANK结合激酶1（TBK1），形成一个信号复合物，激活IFN调节因子3（IRF3）的转录诱导I型IFN。使用多种免疫学和生化方法在多种人类细胞类型中进行的研究表明，GTP酶转运蛋白RAB1B上调RIG-I途径信号传导，从而促进IFN-β诱导和抗病毒反应。观察到RAB1B过表达增加了RIG-I介导的信号传导至IFN-β，而RAB1B缺失则降低了该途径的信号传导。此外，RAB1B的缺失减弱了抗病毒反应，如RAB1B耗竭的细胞对寨卡病毒感染增强。重要的是，研究人员确定了RAB1B在抗病毒反应中的作用机制，发现它与TRAF3形成蛋白质复合物，以促进TRAF3与线粒体抗病毒信号蛋白的相互作用。这些结果表明，RAB1B调节TRAF3，并促进在RNA病毒感染期间对核酸传感的先天免疫信号复合物的形成[9]。

Rab1B是一种重要的GTP酶，参与调节膜转运和信号转导系统。它在多种细胞活动中发挥作用，包括基因表达、蛋白质转运、自噬、先天免疫和肿瘤发生。Rab1B的表达和功能受到多种因素的影响，包括细胞类型、环境信号和遗传背景。Rab1B的异常表达或功能失调与多种疾病的发生和发展有关，包括癌症、血液系统疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病。例如，在乳腺癌中，Rab1B的表达上调与转移性增加有关。在RUNX1杂合缺失中，Rab1B的表达下调导致血小板功能障碍。在弓形虫中，Rab1B的耗竭导致寄生虫生长和形态结构缺陷。因此，Rab1B是细胞功能和疾病发生中的重要调节因子。