Hmgb4-KO 基因敲除小鼠

HMGB4，也称为高迁移率族蛋白B4，是高迁移率族蛋白（HMGB）家族的一个新成员。HMGB蛋白是一类具有独特的DNA结合结构域——HMG盒的非组蛋白，能够结合非B型DNA结构，如弯曲、扭曲和解开的DNA，并通过弯曲/环化和解旋来扭曲DNA。HMGB蛋白在染色质中作为结构因子发挥作用，通过与核小体进行瞬时相互作用、置换组蛋白H1以及促进核小体重塑和核小体DNA对转录因子或其他序列特异性蛋白的可及性，从而影响染色质纤维。

HMGB4在成体小鼠睾丸中强烈表达，在脑中弱表达，而在其他组织中则没有表达。它在染色质中与组蛋白结合，并在转染实验中，与HMGB1相比，它作为转录抑制因子发挥作用。在精子发生过程中，HMGB4存在于晚期粗线期精母细胞和单倍体圆形精子的常染色质中，而在延长阶段，其表达更强，并定位于延长精子核的基极端，与定位于顶端的H1FNT（H1T2）相互排斥。HMGB4基端定位在H1FNT突变精子中丢失，表明H1FNT为核内染色质域的组织提供了位置线索。这些结果表明，HMGB4和H1FNT在延长精子核的顶端和基端指定了不同的染色质域[3]。

在神经细胞中，HMGB4和高度相似的鼠类转化蛋白4（HMGB4L1）被表达。两种蛋白质在活细胞核中具有较慢的迁移率。它们与组蛋白相互作用，并在神经系统转化细胞中其差异表达改变了组蛋白在体外后的翻译后修饰状态。在HEK 293T细胞中过表达HMGB4使细胞对拓扑异构酶抑制剂诱导的细胞死亡更加敏感，并在肿瘤学药物筛选阵列中改变了组蛋白H3的变异组成。在HEK 293T细胞中，HMGB4以p值≤0.013（n=93）的阈值调节了超过800个基因，在微阵列分析中与粘附和组蛋白H2A-过程显示出最强的关联。在神经细胞和转化细胞中，HMGB4调节了少突胶质细胞标记基因PPP1R14a和其他神经元分化标记基因的表达。综上所述，这些数据表明，HMGB4是一种调节染色质和神经元分化标记基因表达的因子[1]。

在男性不育中，遗传变异与该疾病有关，从而揭示了从“组学”角度研究该疾病的实用性。组学旨在分析给定生物功能在整个构成中的结构和功能的不同水平，包括分子基因水平（基因组学）、转录水平（转录组学）、蛋白质水平（蛋白质组学）和代谢物水平（代谢组学）。在对男性不育的公开可获得的转录组数据集进行评估后，共检索到1385个数据集，其中10个数据集符合纳入标准并被用于进一步分析。这些数据集根据疾病或男性不育的原因分为不同的组，包括非梗阻性无精子症（NOA）、梗阻性无精子症（OA）、非梗阻性和梗阻性无精子症（NOA和OA）、精子发生功能障碍、精子功能障碍和Y染色体微缺失。研究发现，8个基因（LDHC、PDHA2、TNP1、TNP2、ODF1、ODF2、SPINK2、PCDHB3）在所有疾病组之间普遍差异表达。同样，56个基因在NOA与NOA和OA之间普遍存在，包括ADAD1、BANF2、BCL2L14、C12orf50、C20orf173、C22orf23、C6orf99、C9orf131、C9orf24、CABS1、CAPZA3、CCDC187、CCDC54、CDKN3、CEP170、CFAP206、CRISP2、CT83、CXorf65、FAM209A、FAM71F1、FAM81B、GALNTL5、GTSF1、H1FNT、HEMGN、HMGB4、KIF2B、LDHC、LOC441601、LYZL2、ODF1、ODF2、PCDHB3、PDHA2、PGK2、PIH1D2、PLCZ1、PROCA1、RIMBP3、ROPN1L、SHCBP1L、SMCP、SPATA16、SPATA19、SPINK2、TEX33、TKTL2、TMCO2、TMCO5A、TNP1、TNP2、TSPAN16、TSSK1B、TTLL2、UBQLN3）。这些基因，特别是上述8个基因，参与多种生物学过程，如生殖细胞发育、精子细胞发育、精子细胞分化、蛋白酶解的调节、精子和代谢过程。由于这些基因的阶段特异性表达，任何表达异常都可能导致男性不育。因此，目前所有与男性生育相关的组学分支的数据可以用来识别诊断男性不育的生物标志物，这有助于揭示一些原因不明的情况[2]。

顺铂是治疗睾丸生殖细胞肿瘤（TGCTs）最常用的抗癌药物。TGCTs对顺铂的敏感性是一个广泛关注的主题。研究表明，HMGB4是一种优先在睾丸中表达的蛋白质，它独特地阻止了顺铂-DNA加合物的切除修复，1,2-内链交联，以增强TGCTs对顺铂治疗的敏感性。使用CRISPR/Cas9介导的基因编辑在睾丸人胚胎癌细胞中敲除HMGB4基因，并检查细胞反应。发现HMGB4的丢失导致对顺铂的耐药性，如细胞增殖和凋亡测定所示。通过使用人TGCT切除修复系统，证明HMGB4特异性地抑制TGCT细胞中主要顺铂-DNA加合物的修复。这些发现还揭示了顺铂处理后细胞周期进程的特征性HMGB4依赖性差异。这些数据提供了令人信服的证据，表明HMGB4在使TGCTs对顺铂敏感方面发挥着重要作用，这与从切除修复中屏蔽铂-DNA加合物一致[4]。

在肺腺癌（LUAD）中，基因启动子的异常DNA甲基化是一个重要特征。然而，DNA甲基化的预后价值仍有待进一步探索。研究发现，一组由11个基因（MYEOV、KCNU1、SLC27A6、NEUROD4、HMGB4、TACR3、GABRA5、TRPM8、NLRP13、EDN3和SLC34A1）组成的DNA甲基化特征，基于DNA甲基化特征计算的特征评分，在预测总生存期时独立于肿瘤复发和TNM分期。值得注意的是，该特征评分与TNM分期的组合比单独的任何一个都提供了更好的总生存期预测。所有高甲基化基因的转录水平在去甲基化后显著增加，而3个低甲基化蛋白的转录水平在肿瘤组织中显著高于正常组织，如人类蛋白质图谱的免疫组化数据所示。结果表明，这些具有预后特征的基因受其启动子DNA甲基化的调节。研究表明，DNA甲基化标记在LUAD预后中具有潜在的应用[5]。

高迁移率族蛋白盒通过视黄醛相互作用依赖和独立机制介导细胞增殖和放射敏感性。之前的研究表明，高迁移率族蛋白1（HMGB1）可以通过LXCXE（亮氨酸-X-半胱氨酸-X-谷氨酸；X=任何氨基酸）基序与视网膜母细胞瘤（RB）蛋白物理相关。HMGB1-3蛋白序列中存在相同的LXCXE基序，而在HMGB4蛋白中则发现了一个近共识的LXCXD（亮氨酸-X-半胱氨酸-X-天冬氨酸；X=任何氨基酸）基序。研究表明，与HMGB1一样，HMGB2-3也通过与RB的体外和体内结合，如谷胱甘肽转移酶捕获和免疫沉淀-Western印迹测定所证实。LXCXE或LXCXD基序的点突变导致RB：HMGB1-4相互作用的破坏。通过腺病毒载体介导的基因转移强制表达HMGB1-3或HMGB4导致乳腺癌细胞增殖显著抑制，并通过LXCXE或LXCXD依赖性机制和LXCXE或LXCXD独立性机制增加了放射敏感性。结果表明，LXCXE/D基序在RB：HMGB1-4结合和调节癌细胞生长方面发挥着重要作用，但对放射敏感性没有影响[6]。

在基于人群的研究中，使用药物-基因相互作用模型识别与抗抑郁药物反应相关的基因位点。在基于人群的研究中，使用多次横断面评估抑郁症状来识别与选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）的潜在基因相互作用，作为研究影响SSRI反应的基因变异的模型。该研究嵌入了前瞻性的鹿特丹研究，包括所有成功基因分型的参与者，并具有抑郁症状数据（CES-D评分）。使用重复测量模型来测试遗传变异和SSRIs使用之间的乘法相互作用对重复CESD评分的影响。在基因组分析之外，还进行了限制在涉及5-羟色胺能信号通路的基因上的分析。在6443名参与者的273次/14,937次抑郁症状评估中，记录了SSRI的使用。经过多重测试校正后，在基因组分析中没有发现可信的位点。然而，在具有最低p值的10个独立位点中，两个基因（FSHR和HMGB4）内的发现可能是有趣的。在26个与5-羟色胺能信号通路相关的基因中，PLCB1基因中的rs6108160多态性在Bonferroni校正后达到了统计学意义（p值=8.1e-5）。此外，在HTR2A基因中广泛复制的102C > T多态性在与SSRI使用的药物-基因相互作用中也显示出统计学意义。因此，该研究表明，基于人群研究中对（重复）横断面抑郁症状评估的药物-基因相互作用模型可以识别可能影响SSRI反应的潜在位点[7]。

RNA-Seq分析揭示了在杂交公牛精子中编码和非编码RNA的功能相关。精子被认为是转录和翻译不活跃的，在染色质浓缩之前，它们会合成RNA和蛋白质。精子将几个功能相关的转录本转移到卵母细胞中，控制母体-合子转变和胚胎发育。本研究使用下一代RNA测序技术在荷斯坦弗里西安 x 塔尔帕卡尔杂交公牛中全面地分析和分析精子转录本。全球转录组分析的结果揭示了13,814个基因的转录本；其中431个转录本的表达量大于1 FPKM，13,383个转录本的表达量大于0或小于1 FPKM。杂交公牛精子中丰富的mRNA转录本为PRM1和HMGB4。基因本体论分析显示，表达量大于1 FPKM的转录本主要参与核糖体的结构成分和翻译。通路富集分析表明，杂交公牛精子转录本与核糖体、氧化磷酸化和剪接体通路相关。通过RT-qPCR验证的选定基因的转录丰度表明，不同公牛之间存在显著差异。总体而言，可以推断杂交公牛精子中的转录本在核糖体的结构成分和翻译、核糖体、氧化磷酸化和剪接体通路等功能中发挥着重要作用。需要进一步使用更大的样本量进行研究，以了解转录组变异对精液质量和生育能力的可能影响[8]。

在男性不育患者中，转录组分析揭示了生殖细胞特异性表达和剪接模式。精子发生过程——生殖细胞分化为精子的过程——受到严格的调控，基因表达失调可能涉及男性不育的病理生理学。睾丸是转录最丰富的组织之一；然而，在精子发生过程中发生的特异性基因表达变化尚未完全了解。为了更好地了解精子发生过程中的基因表达，研究者通过系统地比较在连续的生殖细胞分化步骤中精子发生被阻断的组织的睾丸转录组，生成了生殖细胞特异性全转录组谱。在这些比较中，发现数千个基因在连续的生殖细胞类型之间差异表达。研究者展示了其分析在识别新的高度生殖细胞特异性标记（如TSPY4和LUZP4用于精原细胞；HMGB4用于圆形精子）和男性不育中可能失调的基因（如RWDD2A、CCDC183、CNNM1、SERF1B）方面的潜力。此外，还发现数千个基因显示出生殖细胞特异性异构体（包括SOX15、SPATA4、SYCP3、MKI67）。研究方法和数据集有助于阐明男性不育的遗传和转录原因[9]。

综上所述，HMGB4是一种在多种生物学过程中发挥重要作用的蛋白质，包括染色质组织、神经元分化、男性不育和肿瘤治疗。HMGB4的研究有助于深入理解染色质调控和基因表达的机制，并为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。