Wfdc1-KO 基因敲除小鼠

WFDC1，也称为WAP四硫键核心域蛋白1，是一种编码20kDa前列腺间质蛋白（ps20）的基因。该基因属于WAP型四硫键核心域蛋白家族，具有丝氨酸蛋白酶抑制剂的特性，如elafin和分泌性白细胞蛋白酶抑制剂。WFDC1基因的编码产物ps20包含四个由八个半胱氨酸残基在蛋白羧基末端形成的四硫键。在Wfdc1基因敲除小鼠的研究中，没有发现明显的发育表型，表明其在器官生长和发育中的作用可能不是必需的。然而，WFDC1能够介导内皮细胞迁移和周细胞稳定，这对于形成功能性血管结构至关重要。此外，WFDC1在多种癌症中被发现下调，并对细胞增殖具有调节作用。WFDC1还参与调节人类免疫缺陷病毒感染期间的记忆T细胞。因此，深入研究WFDC1在组织稳态和疾病过程中的调节机制，对于将其作为潜在的治疗靶点具有重要意义[1]。

WFDC1基因编码的ps20蛋白首先被描述为一种由胎儿泌尿生殖窦间质细胞分泌的生长抑制活性物质。纯化的ps20表现出几种与细胞粘附、迁移和增殖相关的活性。WFDC1基因包含七个外显子，并定位于染色体16q24，这表明它可能具有肿瘤抑制因子的功能。然而，目前还没有直接的证据支持这一假设。在体内，ps20可以刺激血管生成，尽管在前列腺癌的反应性间质肿瘤微环境中，WFDC1/ps20的表达下调。WFDC1在其他癌症和炎症状态下的表达存在差异。最近的研究表明，WFDC1在病毒感染中发挥作用。尽管作用机制尚未完全明了，但WFDC1/ps20正在成为一个可能影响对微生物的反应和组织修复稳态的分泌性细胞外基质蛋白[2]。

WFDC1基因编码的ps20蛋白已被鉴定为一种分泌性生长抑制剂，并从大鼠前列腺泌尿生殖窦间质细胞条件培养基中纯化。大鼠cDNA被克隆后，发现ps20包含一个WAP型四硫键核心基序，表明它可能作为一种蛋白酶抑制剂发挥作用。小鼠ps20基因（称为Wfdc1）和人同源cDNA以及人基因（称为WFDC1）已被克隆和表征。小鼠和人类WFDC1基因都包含七个外显子，并编码各自具有79.1%相似性和几乎相同的WAP基序的ps20蛋白。WFDC1基因通过荧光原位杂交分析被定位到人类染色体16q24，这是一个在包括前列腺癌、乳腺癌、肝细胞癌和Wilms瘤在内的多种癌症中频繁发生杂合性缺失（LOH）的区域。WFDC1基因的鉴定和表征可能有助于更好地理解该基因和ps20在前列腺生物学和致癌中的作用[3]。

在牛中，多个眼缺陷（MOD）是一种常染色体隐性遗传性疾病，其特征为晶状体发育不良、视网膜脱离、玻璃体动脉持续存在和小眼症。MOD基因座已定位到牛染色体18的近端区域。在当前的研究中，通过使用受影响动物的系谱进行单倍型分析，将MOD基因座的定位细化到1.0Mb的区间。该区域基因的核苷酸序列比较揭示了WFDC1基因中的一个单核苷酸插入，导致框移突变和蛋白质中部的提前终止密码子。WFDC1是一种含有WAP型四硫键核心域的小分泌蛋白。通过免疫组织化学染色和原位杂交，在胚胎和成年小鼠的眼的晶状体、视网膜和视神经中观察到Wfdc1的特异性表达。这一发现表明WFDC1在哺乳动物眼发育中发挥着重要作用[4]。

WFDC1基因是一个最近被分离出来的人基因，被认为是肿瘤抑制基因的候选基因。目前尚不清楚该基因的突变是否与人类癌症有关。WFDC1基因定位于人类染色体16q24，这是一个在包括肝细胞癌（HCC）在内的几种肿瘤类型中频繁发生LOH的区域。研究者通过检测WFDC1位点的LOH来调查其在46例欧洲HCC中的作用。他们描述了一种使用在WFDC1内含子中发现的两个二核苷酸重复多态性来检测该位点LOH的检测方法，其联合信息量为86%。在40个有信息的HCC样本中，观察到4个样本发生LOH。通过突变、启动子甲基化和基因表达分析，进一步研究了WFDC1作为肿瘤抑制基因候选基因在5个肝细胞癌细胞系和具有LOH的肿瘤中的作用。在显示LOH的HCC样本中，未观察到剩余等位基因的突变。与正常肝脏相比，肿瘤样本中未观察到显著的基因表达上调或下调，并且基因表达似乎与启动子甲基化无关。这些结果表明，如果有的话，WFDC1在肝细胞癌发生中的作用可能是微小的。然而，这种方法可能有助于研究其他肿瘤类型中该候选肿瘤抑制基因的作用[5]。

WFDC1基因经常在前列腺癌中下调或丢失，其编码的蛋白ps20已被认为与上皮细胞行为和血管生成有关。然而，关于ps20的结构和相互作用伙伴的研究仍然很少。研究者使用系统发育重建和其他计算方法对WFDC1/ps20的进化、功能和结构特征进行了表征。贝叶斯系统发育分析表明，ps20出现在后口动物-原口动物的共同祖先中。脊椎动物WFDC1基因编码区内的进化速率和哺乳动物中的共线性保守性与其他脊椎动物谱系不同，这表明ps20同源物可能具有功能多样性。WFDC1周围基因（保守共线性）的基因集富集分析显示，WFDC1、CDH13、CRISPLD2、IRF8和TFPI2基因之间存在功能关系。ps20的分子进化受到纯化选择的影响，尤其是在编码蛋白质最保守区域的3号和4号外显子对应的片段中。协同进化分析表明，这些区域内的残基在ps20的进化过程中相互变化。这些结果表明，3号和4号外显子对应的区域是ps20特有的结构-功能模块。外显子2编码的多肽的相似建模和随后的使用高斯网络模型进行的动力学计算表明，具有高构象灵活性的残基是蛋白质-蛋白质识别中涉及的一个环状区域的一部分，鉴于与其他丝氨酸蛋白酶抑制剂的相似性。C96、R94、L105和C66残基对该ps20区域的完整性和功能至关重要[6]。

WFDC1/ps20蛋白已被确认为前列腺癌细胞系PC3的生长抑制剂。它定位于染色体16q23.1，这是前列腺癌中频繁发生杂合性缺失、家族性相关和基因组丢失的区域。研究者选择检查WFDC1/ps20在前列腺癌中的突变和表达变化。通过测序每个外显子的PCR产物，对21例前列腺癌患者和5个前列腺癌细胞系的DNA进行WFDC1/ps20基因突变的筛选。在23个肿瘤、22个正常邻近前列腺组织样本和35个对照DNA中筛选了5'UTR中SphI多态性。通过Northern印迹和多组织cDNA面板的PCR检查了不同组织类型中WFDC1/ps20的表达模式。通过全长RT-PCR检查了原发性肿瘤中WFDC1/ps20的表达模式，并对产物进行克隆和测序以确定新的剪接形式。在另一组配对肿瘤/良性组织中，通过定量RT-PCR分析了WFDC1/ps20的表达。在WFDC1/ps20基因的编码区未发现与肿瘤相关的突变。在细胞系、肿瘤和正常邻近良性组织的DNA中发现了外显子6中的一种新的多态性。在肿瘤和正常前列腺RNA中发现了一种完全删除外显子3的新剪接形式。定量RT-PCR表明，前列腺肿瘤中WFDC1/ps20的表达显著下调。将正常组织分为间质和上皮部分显示，WFDC1/ps20的表达与间质的数量呈指数相关。因此，WFDC1/ps20在前列腺癌中下调但不是频繁突变，主要在前列腺的正常间质中表达。因此，研究者提出WFDC1/ps20可能不是一个典型的肿瘤抑制基因，但它可能在维持前列腺的正常细胞外基质环境中发挥作用[7]。

在人类黑色素瘤中，细胞和分子机制的确切机制尚不清楚。在NHEM和人类黑色素瘤样本进行的基因表达谱分析中，WFDC1被鉴定为最频繁下调的基因之一。研究者进一步表明，NHEM可以轻易表达WFDC1，但在80%的患者来源的黑色素瘤细胞系和组织样本中，表达减少或完全丢失。此外，研究者发现，在20%的黑色素瘤细胞系中，启动子高甲基化是WFDC1基因沉默的原因。在两个转移性黑色素瘤细胞系A375和LOX中过表达WFDC1，导致小鼠异种移植模型中肿瘤生长显著延迟，尽管体外肿瘤细胞生长没有显著差异。基因表达微阵列分析和进一步的表达验证表明，在WFDC1过表达的细胞系中，Dickkopf-1（Dkk1）基因上调，这表明WFDC1的肿瘤抑制作用可能部分是由于Dkk1基因表达的上调，而Dkk1是一种已知的Wnt信号通路的强力抑制剂[8]。

WFDC1编码的细胞外基质蛋白参与细胞增殖、迁移和上皮-间质转化等疾病条件。尽管如此，Wfdc1基因敲除小鼠没有明显的畸形，而带有WFDC1突变的牛表现出多种眼缺陷，这使得WFDC1在胚胎发育中的作用尚不清楚。为了解决这个问题，研究者使用鸡胚胎作为模型来研究WFDC1在羊膜动物发育中的作用。他们进行了鸡和鼠发育过程中的比较表达分析，揭示了在皮肤和间充质衍生物中的表达，既有保守的也有物种特异性的区域。保守表达在眼睛、耳囊、中枢和外周神经系统以及神经嵴细胞中观察到。在鸡中特有的表达在间充质结构中鉴定出来，包括脊索、肢体和心脏。然而，即使在保守位点如眼睛中，WFDC1定位于不同的视网膜层，这表明在不同物种的视网膜发育和功能中可能存在不同的作用。相反，在鸡胚胎的肢体芽中，WFDC1的表达是特异性的，包括远端间充质、指间膜和芽基。功能富集分析将WFDC1与肢体模式形成、形态发生和Wnt信号通路联系起来。物种特异性差异可能源于基因调控的进化变化，这得到了鸡和鼠WFDC1位点近端顺式调控元件之间的差异的支持。鸡胚胎中WFDC1表达的复杂性，以及鸟类中WFDC1调控的保守性，表明该基因可能在鸟类发育中发挥特定作用，可能有助于形成该谱系特有的特征。未来使用鸡模型的研究将对进一步揭示WFDC1的特定作用具有重要意义[9]。

研究者开发了一个人类黑色素瘤模型，使用HT168-M1细胞系在体外诱导IFN-α2抵抗（HT168-M1res），这已在SCID小鼠体内得到证实。通过比较体外培养的HT168-M1res细胞与其敏感对照的mRNA谱，发现79个差异表达基因（DEGs）。研究者发现，只有13个DEGs的核心在体外稳定，只有4个DEGs的核心在体内稳定。使用IFN治疗的黑色素瘤组织的in silico队列验证了DEGs的一个9基因核心。此外，使用免疫检查点抑制剂（ICI）治疗的黑色素瘤组织的in silico队列测试了DEGs对ICI反应率的预测能力。分析DEGs中上调和下调最显著的四个基因，鉴定出WFDC1、EFNA3、DDX10和PTBP1作为预测基因。分析DEGs的“稳定”基因对ICI反应的预测潜力，揭示了13个基因，其中CDCA4、SOX4、DEK和HSPA1B被鉴定为IFN调节基因。有趣的是，IFN治疗相关基因和ICI治疗预测基因在三个基因中重叠：WFDC1、BCAN和MT2A，这表明这两个生物学过程之间存在联系[10]。

综上所述，WFDC1基因在多种生物学过程中发挥重要作用，包括血管生成、细胞增殖、细胞迁移、免疫调节和病毒感染。WFDC1在多种癌症中被发现下调，表明其可能具有肿瘤抑制因子的功能。WFDC1的表达模式和组织特异性功能研究有助于深入理解其在肿瘤发生和发展中的作用。此外，WFDC1基因的突变与牛的多种眼缺陷有关，这表明其在哺乳动物眼发育中的重要作用。WFDC1基因的表达和功能研究为疾病的治疗和预防提供了新的思路和策略。