Tmem132d-KO 基因敲除小鼠

TMEM132D是一个人类基因，被发现与多种风险等位基因相关，包括恐慌症、焦虑症和重度抑郁症。TMEM132D及其同源物定义了一个保守的跨膜蛋白家族，其分子功能尚不清楚。在秀丽隐杆线虫中，通过生成TMEM132的正交同源基因的基因敲除突变体，发现多巴胺能PDE神经元出现异常形态表型。使用酵母双杂交筛选，发现NAP1直接与人类TMEM132D的细胞质结构域相互作用，秀丽隐杆线虫tmem-132中破坏与NAP1相互作用的突变导致PDE神经元中出现类似的形态缺陷。NAP1是控制F-肌动蛋白细胞骨架动力学的WAVE调节复合物(WRC)的组成部分。降低WRC的活性可以挽救tmem-132突变体的PDE缺陷，而在哺乳动物细胞中TMEM132D的获得性功能抑制WRC，导致WRC成分减少，肌动蛋白成核和细胞运动受损。这表明，多细胞生物TMEM132家族蛋白在调节NAP1蛋白同源物以限制不适当的WRC活性、细胞骨架和形态变化方面发挥着进化上保守的作用[1]。

在一项针对恐慌症患者的全基因组关联研究中，发现TMEM132D基因内含子3中的两个单核苷酸多态性(SNPs) (rs7309727和rs11060369)组成的危险单倍型与恐慌症相关。在新的独立样本中，证实了rs7309727和风险单倍型rs7309727-rs11060369与恐慌症的相关性，其中主要恐慌症患者的信号最强。当将样本限制为欧洲血统个体时，风险单倍型和rs7309727的P值分别达到P = 1.4e-8和P = 1.1e-8。在日本样本中没有发现与恐慌症的相关性。这些结果支持了最初的发现，即TMEM132D基因对欧洲血统个体的恐慌症遗传易感性有贡献。研究结果还表明，患者确定和遗传背景可能是不同人群中影响这种相关信号异质性的重要来源[2]。

TMEM132D是一个候选基因，其风险基因型与恐慌症患者的焦虑程度相关，并且在恐慌症患者的额叶皮层中mRNA表达更高。在具有高焦虑特质(HAB)和低焦虑特质(LAB)的鼠模型中，与LAB小鼠相比，HAB小鼠的前扣带皮层(aCC)中Tmem132d的表达增加。为了了解这种差异表达的分子基础，研究人员对基因进行了测序，并在两种系之间发现两个SNPs，这两个SNPs可以解释观察到的mRNA表达谱。此外，在HAB与LAB Tmem132d启动子区域中包含的CpG岛中，没有发现DNA甲基化水平有差异。此外，研究人员发现，与LAB位点的相应位置相比，RNA聚合酶II(POLR2A)对HAB特异性SNP(rs233264624)的近端结合显著更高，这表明转录增加。病毒介导的Tmem132d在C57BL/6J小鼠aCC中的过表达证实了它在介导焦虑表型中的作用。为了模拟基因-环境相互作用，HAB小鼠在丰富环境(HAB-EE)中的暴露导致焦虑水平降低，但与标准饲养的HAB(HAB-SH)小鼠相比，Tmem132d mRNA表达增强。而LAB小鼠在不可预测的慢性轻度应激(LAB-UCMS)下表现出更高的焦虑水平，并且与标准饲养的LAB(LAB-SH)小鼠相比，mRNA表达降低。染色质免疫沉淀显示，HAB-EE在rs233264624位点的POLR2A结合显著更高，而LAB-UCMS在此位点的POLR2A结合更低，从而解释了与各自SH对照组相比，Tmem132d表达的增强或减弱。为了进一步研究基因-环境相互作用，使用Illumina 450K BeadChip对74名恐慌症患者进行了DNA甲基化评估。根据积极生活事件的数量，在TMEM132D中观察到两个CpGs(cg26322591和cg03283235)的显著甲基化差异，这支持了环境积极线索对小鼠中Tmem132d表达调节的影响结果[3]。

非小细胞肺癌(NSCLC)对奥希替尼的获得性耐药是一个主要障碍。目前关于长非编码RNA(lncRNA)在这一现象中的作用知之甚少。在这项研究中，研究人员筛选了奥希替尼敏感和耐药NSCLC细胞系之间差异表达的lncRNA，并确定lnc-TMEM132D-AS1在奥希替尼耐药NSCLC细胞中显著上调，以及在奥希替尼耐药NSCLC患者血浆中也上调。lnc-TMEM132D-AS1显著降低了NSCLC细胞对奥希替尼的敏感性。奥希替尼处理后，它增加了细胞增殖和集落形成，降低了细胞凋亡，并诱导M2/G期细胞周期阻滞。在确定其细胞质定位后，构建了一个功能性的lnc-TMEM132D-AS1-miRNA-mRNA相互作用网络和一个蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，以分析其假定的靶基因和生物学功能。lnc-TMEM132D-AS1可以直接与miR-766-5p结合，导致ectonucleoside三磷酸二磷酸水解酶-1(ENTPD1)的上调，从而增加细胞增殖。此外，上调的ENTPD1也与NSCLC患者肿瘤中免疫抑制细胞的增强浸润和不良预后相关。总的来说，lnc-TMEM132D-AS1在奥希替尼耐药中起着至关重要的作用。它可能作为预后生物标志物和NSCLC对奥希替尼获得性耐药的潜在治疗靶点[4]。

视网膜脱离(RD)是一种由神经感觉视网膜与底层视网膜色素上皮层分离引起的威胁视力的眼病。由于其数据有限，其遗传基础尚不清楚。在这项研究中，研究人员旨在识别与RD相关的遗传风险位点，并构建多基因风险评分(PRS)来预测RD的风险。使用来自台湾生物银行的数据进行了全基因组关联研究，以识别RD风险位点。共招募了1533例RD病例和106270名对照者，所有参与者均为汉族。使用来自英国生物银行和日本生物银行的数据进行了复制研究。为了构建PRS，使用传统的聚簇和阈值方法进行，并通过五倍交叉验证进行验证。共鉴定出两个与RD显著相关的全新位点。这两个基因是TMEM132D(主要SNP: rs264498，调整后的P = 7.18 × 10-9)和VIPR2(主要SNP: rs3812305，调整后的P = 8.38 × 10-9)。开发的PRS能够有效地区分高风险和低风险个体，具有剂量反应关系。最高风险组的优势比(OR)为1244.748，与最低风险组相比(95%置信区间，175.174-8844.892)。TMEM132D和VIPR2的基因多态性是汉族人群中RD的遗传候选基因。提出的PRS能够有效地区分高风险和低风险个体[5]。

终身恐慌症的患病率高达全球的4%，并且有大量证据表明遗传因素在恐慌症的发生发展中发挥作用。在一项全基因组关联研究中，发现TMEM132D中的单核苷酸多态性(SNPs)与恐慌症相关，在三个独立样本中，每个样本中的两个SNP单倍型都相关，在合并样本(909例，915例对照)中P值为1.2e-7。该基因中的独立SNPs也与恐慌症或恐慌发作患者的焦虑症状严重程度相关，以及与单极抑郁症患者的焦虑症状严重程度相关。恐慌症的风险基因型与额叶皮层中TMEM132D mRNA表达水平升高相关。平行地，使用一种具有极端焦虑特质的鼠模型，研究人员进一步表明，焦虑相关行为与Tmem132d mRNA在处理焦虑/恐惧相关刺激的关键区域——前扣带皮层中的表达呈正相关，并且在这个动物模型中，Tmem132d SNP与F2面板中的焦虑相关行为相关。因此，TMEM132D可能是恐慌症的一个重要新候选基因，以及更广泛地说，是焦虑相关行为的一个新候选基因[6]。

为了筛选出奥希替尼获得性耐药非小细胞肺癌(NSCLC)细胞中差异表达的长非编码RNA(lncRNA)，并探讨筛选出的lncRNA在奥希替尼获得性耐药中的作用及其分子机制，研究人员建立了奥希替尼获得性耐药NSCLC细胞模型。使用CCK-8、克隆形成和流式细胞术检测细胞对奥希替尼的敏感性；使用RNA测序(RNA-seq)和实时荧光定量PCR(qPCR)技术筛选耐药前后差异表达的lncRNA；采用CCK-8、克隆形成和Transwell实验检测所筛选的lncRNA在NSCLC细胞奥希替尼获得性耐药中的作用；通过核质分离、生物信息学分析和qPCR技术观察该lncRNA的亚细胞定位，并探索其下游互作分子。H1975_OR和HCC827_OR对奥希替尼的耐药指数分别为598.70和428.82(P < 0.001)。耐药株的生长增殖与克隆形成能力显著提高，而凋亡率降低(P < 0.01)。RNA-seq提示H1975_OR与H1975_S之间以及HCC827_OR与HCC827_S之间有共同差异表达的lncRNA 34个。qPCR验证发现，lnc-TMEM132D-AS1在耐药性NSCLC细胞株中升高最为显著(P < 0.01)。TCGA数据库分析提示，lnc-TMEM132D-AS1在NSCLC组织中的表达水平高于癌旁组织(P < 0.001)，且与患者预后不良相关(P < 0.05)。LncTMEM132D-AS1过表达可提高奥希替尼处理下敏感株的生长增殖、克隆形成及迁移能力(P < 0.05)，而敲低其表达水平可部分恢复耐药株的奥希替尼敏感性(P < 0.01)。lnc-TMEM132D-AS1主要定位在胞质，生物信息学分析提示hsa-miR-766-5p是其潜在靶点，两者表达水平呈负相关(P < 0.01)。对hsa-miR-766-5p下游的靶mRNA分析提示相关基因主要集中于Ras信号通路。lnc-TMEM132D-AS1在奥希替尼获得性耐药NSCLC细胞株中表达显著上调，明显降低了NSCLC细胞对奥希替尼的敏感性，是NSCLC奥希替尼获得性耐药的潜在生物标志物及治疗靶标[7]。

基因组关联研究(GWAS)已经揭示了跨膜蛋白132D(TMEM132D)是恐慌症(PD)的敏感基因。作为儿童创伤经历的主要类型，儿童虐待已成为国内外备受关注的公共卫生问题，并被证明是PD发病的风险因素。然而，它如何影响恐慌症的发生和发展尚未揭示。研究人员基于这一发现，研究了TMEM132D甲基化、儿童虐待和症状之间的关系。招募了32名PD患者和22名健康对照者(HCs)，在年龄、性别和教育水平匹配后。使用基因组DNA样本(PD，N = 32，对照，N = 22)从受试者的肘静脉血中检查了全基因组CpG位点的DNA甲基化水平。使用中介模型探讨不同CpG位点的甲基化程度与儿童虐待和临床症状之间的关系。研究发现，PD组在CpG1、CpG2、CpG3、CpG4、CpG5、CpG6、CpG7、CpG8、CpG11、CpG14和CpG18的甲基化水平显著低于HCs(p < 0.05)。TMEM132D基因启动子区域CpG2位点与PDSS评分呈正相关(r = 0.5953，p = 0.0117)。TMEM132D基因启动子区域CpG2位点与身体虐待呈正相关(r = 0.4889，p = 0.046)。此外，路径分析显示，TMEM132D的CpG2甲基化在身体虐待与PD症状严重程度之间的关系中起完全中介作用(95%)。儿童虐待经历，尤其是身体虐待，与PD显著相关。TMEM132D的CpG2甲基化在恐慌症和身体虐待之间显示出完全中介作用。TMEM132D甲基化与身体虐待的相互作用可以预测恐慌症[8]。

卵巢癌中细胞毒性T淋巴细胞的浸润是一个有利预后因素。通过差异表达方法，研究人员最近已经鉴定出与早期卵巢肿瘤中CD8+ T细胞浸润相关的一系列基因。在目前的研究中，研究人员通过qPCR验证了GPC6和TMEM132D的表达，这两个基因编码跨膜蛋白，在一组早期卵巢癌患者中。两种基因的表达均与CD8A mRNA水平呈正相关，CD8A是T淋巴细胞浸润的标志[Pearson系数: 0.427(p = 0.0067)和0.861(p < 0.0001)]。GPC6和TMEM132D的表达也在多种卵巢癌细胞系中得到证实。重要的是，Kaplan-Meier生存分析显示，GPC6和/或TMEM132D mRNA的高水平与早期卵巢癌患者的总生存率显著相关(p = 0.032)。因此，GPC6和TMEM132D可能作为CD8+ T淋巴细胞浸润的预测因子，以及作为早期卵巢癌中有利预后的标记物，这对诊断、预后和肿瘤免疫治疗具有重要意义[9]。

全基因组关联研究已经确定了与常见疾病相关的常见变异。然而，大多数变异只能解释一小部分估计的遗传力，这表明罕见变异可能比目前认为的更大程度地贡献于常见疾病。研究人员使用下一代测序测试了这些变异是否通过重新测序40kb，包括TMEM132D位点所有外显子的方式，来为焦虑症的风险做出贡献。使用下一代重新测序技术对300名患有焦虑症的患者(大部分为恐慌症，占84.7%)和300名健康对照者的DNA进行筛选，以检测遗传变异的存在。使用个体重新分型验证结果。共鉴定出371个变异，其中247个尚未报道过，包括15个新的非同义变异。这些变异中的大多数(76%)的次要等位基因频率小于5%。虽然没有在TMEM132D中识别出与恐慌症相关的其他常见变异，但观察到在健康对照者中，假定功能的编码变异比病例中更多，以及病例中私人编码变异的比率更高，其中一个非同义编码变异存在于4名患者中，但在任何匹配的对照者中或超过5500个来自不同种族背景的个体的公开可用重新测序数据集中均不存在。这些数据表明，不仅常见变异，而且TMEM132D内的假定功能的/或罕见变异也可能对焦虑症的风险发展有所贡献[10]。

综上所述，TMEM132D是一个重要的基因，在多种生物学过程中发挥作用，包括细胞骨架动力学、细胞增殖、细胞凋亡和免疫浸润。TMEM132D的基因变异和表达水平与多种疾病相关，包括恐慌症、焦虑症、非小细胞肺癌和视网膜脱离。此外，TMEM132D的甲基化状态和基因-环境相互作用也对疾病的发生发展有影响。因此，TMEM132D是一个有潜力的治疗靶点和预后生物标志物，值得进一步研究。