Zic4-KO 基因敲除小鼠

ZIC4，也称为锌指蛋白4，是ZIC基因家族中的一员，属于锌指蛋白家族。ZIC基因家族编码的是一组在成年小鼠脑中仅在大脑小脑中表达的锌指蛋白。ZIC基因是果蝇配对规则基因odd-paired (opa)的脊椎动物同源物。通过基因组学和cDNA克隆研究，研究人员鉴定出了一种新的基因ZIC4，它具有与ZIC1、ZIC2和ZIC3相似的结构，尤其是在其锌指结构域中。基因组组织分析表明，ZIC4基因与ZIC1、ZIC2、ZIC3和opa基因共享共同的剪接位点。ZIC4基因定位于小鼠9号染色体上，靠近ZIC1基因。RNA酶保护研究表明，ZIC4基因在成年小鼠的小脑中表达，与其他ZIC基因的表达模式相似。在发育中的小脑中，ZIC4 mRNA的表达量在出生后第5天达到峰值，这表明ZIC4基因可能与其他ZIC基因在小脑发育过程中协同工作[1]。

多系统萎缩（Multiple System Atrophy，MSA）是一种罕见的神经退行性疾病，其特征是神经胶质细胞中的α-突触核蛋白聚集，并伴随橄榄脑桥小脑萎缩或纹状体黑质变性，导致自主神经功能障碍、帕金森综合征和小脑共济失调。在之前的一项全基因组关联研究中，研究人员发现了一些与MSA相关的常见遗传变异，包括位于3号染色体上的rs16859966、8号染色体上的rs7013955和4号染色体上的rs116607983。这些基因中，ZIC1和ZIC4编码的是小脑1号和4号锌指蛋白。由于ZIC1和ZIC4基因的突变以及针对ZIC4的副肿瘤自身抗体与小脑功能严重障碍相关，研究人员对24例MSA患者的脑组织进行了免疫组织化学分析。结果显示，在所有健康对照和纹状体黑质变性患者的齿状核神经元中，ZIC4的免疫组织化学表达都较强，而在橄榄脑桥小脑萎缩患者的齿状核神经元中，ZIC4的免疫反应性神经元数量显著减少。这些发现表明，ZIC4可能在MSA中发挥着神经元易损性的作用[2]。

Codonopsis pilosula多糖（CpP）对小鼠脑类器官（mBO）损伤的保护机制进行了分析，并研究了rotenone对小鼠脑类器官的基因组表观遗传修饰和生理活性的影响。病理实验表明，rotenone显著损伤了小鼠脑类器官的亚细胞器。根据RRBS-Seq数据，rotenone显著促进了小鼠脑类器官中基因体的过度甲基化修饰。分子生物学实验证实，rotenone显著促进了小鼠脑类器官中Zic4、Pgm5和Camta1基因体的过度甲基化修饰，其表达水平显著低于对照组。生物信息学分析表明，转录因子ZIC4的多个结合基序存在于Pgm5（磷酸葡萄糖变位酶5）和Camta1（钙调蛋白结合转录激活因子1）基因的启动子区域。当Zic4的表达被沉默时，小鼠脑类器官的增殖显著减少，PGM5的表达水平也显著降低。此外，CpP处理小鼠脑类器官显著降低了rotenone的细胞毒性，促进了细胞周期进程，增加了细胞内谷胱甘肽活性，显著诱导了Zic4、Pgm5和Camta1基因体的去甲基化修饰，并促进了ZIC4和PGM5的高表达。因此，研究证实CpP通过下调Zic4/Pgm5/Camta1轴的基因体DNA甲基化修饰来减轻rotenone诱导的小鼠脑类器官死亡[3]。

在肝细胞癌（HCC）的发生和发展过程中，肿瘤抑制基因的失活起着至关重要的作用。ZIC家族成员4（ZIC4）是一种转录因子，在发育过程中发挥着重要作用。然而，ZIC4在HCC中的表达和生物学作用尚不清楚。基于TCGA数据库的生物信息学分析显示，HCC中存在ZIC4的异常高甲基化。ZIC4在HCC细胞和组织中频繁发生启动子区域的甲基化，并下调表达。功能上，ZIC4的抑制促进了HCC细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化（EMT）。相反，ZIC4的过表达降低了HCC细胞的增殖和侵袭性。此外，ZIC4的抑制挽救了EZH2敲低或EZH2抑制剂引起的抗肿瘤作用。机制上，EZH2敲低或EZH2抑制剂减少了ZIC4启动子区域EZH2和H3K27me3的富集，导致ZIC4的上调。总的来说，这些数据表明，EZH2介导的H3K27me3导致的ZIC4的表观遗传沉默是HCC中的重要机制，并为肝细胞癌的治疗提供了一个新的治疗靶点[4]。

水螅头部形成依赖于一个组织中心，其中Wnt/β-连环蛋白信号传导起着诱导作用，正向调节Sp5和ZIC4，Sp5限制Wnt3/β-连环蛋白的表达，而ZIC4触发触须的形成。研究人员使用转基因系，其中HySp5启动子驱动在表皮或外胚层中表达eGFP，发现Sp5启动子活性在每种上皮层中都有所不同。在完整动物中，表皮HySp5:GFP活性在顶端处强，沿身体柱弱，而在外胚层中，在触须环区域最强，沿上半身柱保持高水平。在顶端再生过程中，HySp5:GFP在外胚层中早期被激活，在表皮中较晚被激活。Alsterpaullone处理导致顶端HySp5:GFP表达向身体柱转变，在表皮中形成短暂的圆形图案。在β-连环蛋白（RNAi）处理后，HySp5:GFP在外胚层中的活性下调，而在外胚层中表达HySp5:GFP的芽状结构得以发展。Sp5（RNAi）揭示了外胚层中Sp5的负性自身调节，而在外胚层中没有。这些在外胚层和外胚层中的差异调节突出了Wnt/β-连环蛋白/TCF/Sp5/ZIC4网络在完整动物的下唇、触须基底部和身体柱中的不同结构，以及在芽和顶端和基底部再生尖端中的结构[5]。

神经管缺陷（NTDs）的潜在机制之一是表观遗传失调。多环芳烃（PAHs）是一类环境污染物，据报道是NTDs的风险因素，可能会引起全基因组DNA甲基化水平降低。这项研究使用从神经组织中提取的DNA，确定了与NTDs风险增加相关的低甲基化基因，并检查了其低甲基化是否与PAH暴露相关。使用来自10例NTD病例和8例对照的Infinium HumanMethylation450 BeadChip阵列的数据，研究人员确定了ZIC4、CASP8、RAB32、RARA和TRAF6为NTD相关低甲基化基因家族中最显著的五个基因。在所有鉴定的基因中，ZIC4在启动子和5' UTR区域具有最多不同的甲基化CpG位点（n = 13）。在一个独立的80例病例和32例对照的队列中，使用Sequenom EpiTYPER平台验证了ZIC4启动子和5' UTR区域显著降低的甲基化水平（p < 0.001）。ZIC4的甲基化水平与胎儿肝脏中高分子量PAHs水平呈负相关。在胎儿神经组织中，ZIC4启动子和5' UTR区域的6个和3个CpG位点分别与抗氧化指标和蛋白质氧化指标呈负相关（ρ: -0.45至-0.75，p < 0.05）。在一个全胚胎培养的小鼠模型中，在BaP暴露后观察到Zic4启动子和5' UTR区域的低甲基化和Zic4的上调，以及NTD发生率的增加。抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸可以恢复正常BaP暴露组的变化。ZIC4启动子和5' UTR区域的低甲基化可能增加NTDs的风险；氧化应激可能在Zic4对PAH暴露的反应中发挥重要作用[6]。

我们的目的是研究小鼠胚胎发生过程中离散丘脑核的发展机制（包括雌性和雄性）。我们描述了转录因子编码基因Zic4及其谱系细胞分布的表达。我们使用遗传谱系追踪来证明Zic4谱系细胞主要贡献于丘脑核的子集，特别是外侧膝状核（LGNs），它们是视觉通路的关键组成部分。我们观察到几乎所有的Zic4谱系中脑祖细胞在不同位置依赖性水平上表达转录因子Pax6。我们使用条件性突变来从Zic4谱系细胞中删除Pax6的一个或两个拷贝。我们发现，带有Pax6同型或杂合缺失的Zic4谱系细胞异常地大量贡献于一个或两个主要外侧膝状核（LGNs）。这不能归因于细胞产生的变化，很可能是由丘脑细胞的分离改变引起的。我们的结果表明，由中脑祖细胞中Pax6水平的定位信息是它们子细胞最终位置的重要决定因素[7]。

Zic家族成员ZIC4是一种转录因子，已在多种癌症中被证实沉默。然而，对ZIC4在儿科脉络丛肿瘤（CPTs）中的调控和功能了解有限。这项研究利用数据挖掘和生物信息学分析来调查ZIC4在CPTs中的DNA甲基化状态及其与患者生存的相关性。结果揭示了ZIC4甲基化作为一个分离因素，将CPT队列分为两个簇，其中过度甲基化与不良预后相关。在脉络丛癌衍生的细胞系（CCHE-45）中，通过亚硫酸氢盐测序证实了ZIC4的过度甲基化。此外，研究还表明，去甲基化剂和组蛋白甲基转移酶抑制剂可以逆转ZIC4的沉默。RNA测序和蛋白质组学分析显示，ZIC4的过表达影响了与免疫反应、抗原处理和呈递、内质网应激和代谢相关的基因和蛋白质。功能上，重新表达ZIC4对细胞增殖和迁移产生负面影响。最终，这些发现突出了ZIC4过度甲基化作为CPTs中的预后标志物，并揭示了其在CPC中肿瘤抑制作用的潜在机制。这一见解为治疗侵袭性CPTs提供了新的治疗靶点[8]。

鲫鱼包含七个zic基因，其中两个，zic1和zic4，已被广泛研究。分析主要基于双肛门鳍（Da）突变体，它是从野生型中分离出来的。Da是zic1/zic4的增强突变体，zic1/zic4的表达在体节的背侧一半中特异性丢失，导致从幼虫到成虫的体节腹侧一半在侧中线处形成镜像复制。对鲫鱼Da的研究为我们提供了关于zic1/zic4在间充质组织中的功能的重要见解，也揭示了脊椎动物躯干部在晚期发育过程中背腹模式形成机制的长期未解之谜。在本章中，我们介绍了鲫鱼zic基因的基因组组织，并讨论了它们的函数，主要关注zic1和zic4在躯干部背腹模式形成中的作用以及与人类先天性疾病的可能联系[9]。

丘脑的主要感觉核处理和传递平行通道的感官输入到大脑皮层。这些核获得不同功能角色的发育过程尚不清楚。为了识别具有潜在作用的基因群，研究人员对主要听觉传递核，即内侧膝状核（MGN）和主要视觉传递核，即外侧膝状核（LGN）在围产期的基因表达进行了微阵列筛选。他们发现并确认了通过qRT-PCR和原位杂交证实的具有高度排名的差异化表达基因。对Zic4的功能进行了研究，Zic4是一种在LGN中高度富集的转录因子，使用Zic4基因敲除小鼠发现，其视网膜膝状体投射的拓扑模式发生了变化。Foxp2是一种在MGN中强烈表达的转录抑制因子，被发现在MGN中由活动正向调节。这些发现确定了两个差异化表达基因Zic4和Foxp2在视觉和听觉通路发展中的作用。最后，为了测试模式特异性基因表达模式是否受外部输入模式的影响，研究人员进行了另一个微阵列筛选，比较了正常的MGN和“重新连接”的MGN，其中正常的听觉传入被切除，新的视网膜传入支配MGN。这个筛选的数据表明，重新连接的MGN获得了LGN中存在的一些基因表达模式，包括Zic4表达的上调，以及可能代表跨模式可塑性独特过程的新的表达模式[10]。

综上所述，ZIC4是一种重要的转录因子，在脊椎动物发育过程中发挥着重要作用。ZIC4基因的表达主要局限于大脑小脑，并在小脑发育过程中与其他ZIC基因协同工作。ZIC4基因的突变或表观遗传沉默与多种神经退行性疾病和癌症的发生发展密切相关。此外，ZIC4基因的表达和功能还受到其他转录因子和信号通路的调控，如Pax6和Wnt/β-连环蛋白信号通路。ZIC4基因的研究有助于深入理解脊椎动物发育的分子机制，为神经退行性疾病和癌症的治疗提供新的思路和策略。