Zic3-KO 基因敲除小鼠

ZIC3，也称为锌指蛋白Zic3，是一种C2H2型锌指转录因子，它在脊椎动物胚胎的早期模式形成中发挥着重要作用[2]。人类患者中ZIC3基因的突变会导致复杂的发育表型，包括左右侧缺陷、先天性心脏病以及腰骶部和肛门异常，包括神经管缺陷[2]。这些发现表明ZIC3在发育过程中对于建立正确的左右轴和中线神经模式起着重要作用。

ZIC3基因在异位中的作用已被广泛研究。突变ZIC3会导致X连锁异位，这是一种内部器官左右侧被破坏的综合征。对模型生物和早期发育过程中基因表达的分析表明，ZIC3相关异位是由于左右轴形成的最早阶段出现缺陷[1]。尽管有数据支持节点和纤毛的异常作为潜在原因，但在分子水平上，ZIC3功能丧失为何会导致这些缺陷仍然不清楚。ZIC3在多个发育信号通路中具有假设的作用，这些通路在建立左右轴方面具有不同的作用。这使人们对Zic3在早期发育和左右图案形成中的机制基础的理解变得复杂。

ZIC3基因变异在异位中的临床意义已被证实。在ZIC3基因中发现的变异非常罕见，但它们在X连锁异位中具有深刻的临床意义，特别是影响那些具有胸部和内脏器官异常排列的男性患者。几个报告已经表明，ZIC3基因变异在家族性和散发性病例中都具有相关性，并且在锌指结构域中检测到的突变占主导地位[3]。通过对348名患有各种先天性心脏病的患者进行筛查，发现6种新的致病性变异（1.7%），这些变异要么发生在患有异位的男性患者（n=5）中，要么发生在家族中有多个男性死于异位的女性患者（n=1）中。所有变异都位于锌指结构域内或导致这些结构域之前的截断。截断性变异导致突变ZIC3蛋白的异常转运，而错义变异则显示出正常的转运。在斑马鱼中过表达野生型ZIC蛋白和突变ZIC蛋白表明，两种移码变异完全失去了功能，而错义变异与野生型相比具有部分活性，这进一步突出了这些变异的致病性。

ZIC3基因的突变也与异位综合征和先天性心脏病有关。在一项针对66名来自无相关家庭的异位综合征患者的研究中，对22个候选基因进行了目标下一代测序（NGS）。在七个基因中发现了21个潜在的致病性变异。随后，使用Sanger测序在家族系谱中确认了这些变异，并发现了一个男性患者中ZIC3基因的一个新的半合子突变（c.890G>T，p.C297F），该突变是从他的母亲那里继承的，而他的母亲是一个携带者。功能研究表明，这种ZIC3突变降低了转录活性，影响了GLI结合位点的亲和力，并导致转染细胞中的异常细胞定位。此外，在斑马鱼中的形态素敲低实验表明，zic3突变mRNA未能挽救异常表型，这表明新的ZIC3突变在异位综合征中发挥作用[4]。

ZIC3基因在脊椎动物中的保守性也得到了证实。在脊椎动物中，Zic3编码一种锌指蛋白，对中胚层和外胚层组织的发育至关重要。在哺乳动物中，Zic3在神经管、轴向骨骼、左右身体轴的发育以及维持胚胎干细胞（ES细胞）的多能性方面发挥着重要作用。通过使用鸡全胚胎电穿孔筛选人-鸡保守的非编码序列周围的Zic1和Zic3的增强子活性，确定了中胚层增强子（Zic3-ME）。Zic3-ME在鸡和鼠胚胎的中胚层组织中显示出强大的增强子活性，并被证明对小鼠中胚层Zic3的表达至关重要[5]。这些结果表明，Zic3-ME是一个综合的顺式调控元件，对于脊椎动物中Zic3的正确表达至关重要，并且作为一个包括Zic3在内的基因调控网络的枢纽。

ZIC3基因还与其他转录因子协同作用，以维持人类ES细胞的多能性。在人类胚胎干细胞模型中，转录因子ZIC2和ZIC3具有重叠但必不可少的作用，可以打开初级特异性增强子。它们共同对促进向初级多能性的进展和维持初级多能性至关重要。ZIC2/3通过招募SWI/SNF到染色质来完成这一过程，ZIC2/3或SWI/SNF的降解都会阻止增强子的激活。ZIC2/3的丧失还会导致转录组发生变化，这些变化与多梳蛋白活性的紊乱一致，并且向表达与中胚层分化相关的基因转变。此外，还发现对转录机制的依赖性，以持续招募ZIC2/3到初级ES细胞特异性增强子上。总的来说，ZIC2和ZIC3调节高度动态的谱系特异性增强子，并共同作为人类初级多能性的关键调节因子[6]。

ZIC3蛋白与GLI3转录因子的相互作用也在研究中得到了描述。ZIC3是一种GLI超家族转录因子，参与建立正常的胚胎左右图案。在携带Zic3突变的小鼠中观察到了中枢神经系统（CNS）和轴向骨骼的多种异常。先前的研究表明，ZIC3蛋白可以结合到GLI共识结合位点（GLIBS）并与GLI3物理相互作用，GLI3是一种参与神经和骨骼发育多个方面的转录因子。体外研究表明，所有五个完整的锌指结构域都是ZIC3与GLIBS结合所必需的。将GLIBS置于基础TK启动子上游对ZIC3单独激活启动子没有影响，但它增强了ZIC3和GLI3的协同激活。野生型（WT）ZIC3在GST-pull-down试验中显示出与GLI3的特异性结合。缺失一个或多个锌指结构域的无义和移码ZIC3突变体没有与GST-GLI3发生物理相互作用；然而，两个错义突变体c.1213A>G（p.K405E，第五个锌指结构域）和c.649C>G（p.P217A，保守的N末端结构域）保留了结合。荧光素酶报告基因试验表明，p.P217A和p.K405E突变体也保留了与GLI3的协同激活，而所有不与GLI3结合的ZIC3突变体都缺乏这种活性。有趣的是，在携带p.P217A或p.K405E突变的病人中，没有观察到CNS或骨骼异常[7]。

此外，ZIC3基因的表达还受到其他转录因子的调控。在非洲爪蟾胚胎研究中，BMP4/Smad1靶向基因回路是确定细胞命运在神经外胚层和神经外胚层之间以及腹侧和背侧中胚层之间的重要信号通路。在这种情况下，已经确定了几个BMP4/Smad1靶向转录因子作为神经外胚层的抑制因子。然而，在这些途径中，包括GATA1b、Msx1和Ventx1.1在内的直接靶向转录因子尚未被证明是早期神经外胚层基因表达的直接抑制因子。为了证明Ventx1.1是神经外胚层基因的直接抑制因子，对Ventx1.1进行了全基因组非洲爪蟾ChIP-Seq。研究表明，Ventx1.1结合到zic3启动子上的Ventx1.1反应顺式作用元件1和2（VRE1和VRE2），导致zic3转录的抑制。对zic3启动子中VRE1和VRE2的位点定向突变完全消除了Ventx1.1引起的抑制。此外，还发现FoxD5b和Xcad2对zic3启动子活性的正负调节分别通过VREs和Ventx1.1水平的调节发生。总的来说，结果表明BMP4/Smad1靶向基因Ventx1.1是非洲爪蟾胚胎早期神经外胚层基因zic3的直接抑制因子[8]。

综上所述，ZIC3是一种重要的转录因子，在脊椎动物胚胎的早期模式形成中发挥着关键作用。ZIC3基因的突变会导致多种发育缺陷，包括左右侧缺陷、先天性心脏病和神经管缺陷。ZIC3在多个发育信号通路中具有假设的作用，这些通路在建立左右轴方面具有不同的作用。ZIC3与其他转录因子协同作用，以维持人类ES细胞的多能性。ZIC3蛋白与GLI3转录因子的相互作用也在研究中得到了描述。此外，ZIC3基因的表达还受到其他转录因子的调控。因此，ZIC3的研究对于深入理解早期发育和左右图案形成的机制基础具有重要意义。