Nkx2-1-KO 基因敲除小鼠

Nkx2-1基因，也称为甲状腺转录因子1（TTF-1），是一个包含同源结构域的转录因子，对于甲状腺、肺和腹侧前脑的形态发生和分化至关重要。它控制着甲状腺、肺和中央神经系统中选择基因的表达。在肺中，TTF-1控制着对肺稳定性和肺宿主防御至关重要的表面活性蛋白的表达。人类TTF-1由位于14号染色体上的单个基因编码，并组织成两个/三个外显子和一个/两个内含子。多个转录起始位点和选择性剪接产生在5'端具有异质性的mRNA。TTF-1 mRNA的3'端以较长的非翻译区域为特征。人类、大鼠、小鼠和其他物种的TTF-1的氨基酸序列非常相似，表明序列高度保守。TTF-1启动子活性由HNF-3（肝细胞核因子-3）、Sp（特异性蛋白）1、Sp3、GATA-6和HOXB3（同源框B3）转录因子的组合或协同作用维持。关于激素、细胞因子和其他生物剂对TTF-1基因表达的调控，信息有限。糖皮质激素、cAMP和TGF-β（转化生长因子-β）对TTF-1表达有刺激作用，而TNF-α（肿瘤坏死因子-α）和神经酰胺对肺细胞中的TTF-1 DNA结合活性有抑制作用。人类TTF-1的杂合子不足会导致甲状腺功能减退、呼吸功能障碍和反复的肺部感染，这强调了TTF-1水平对维持甲状腺和肺功能的重要性。最近的研究将TTF-1确定为肺癌的谱系特异性原癌基因[1]。

结节性甲状腺肿可能增加甲状腺癌的风险，但其遗传因素尚不清楚。在甲状腺肿组织中，H19 lncRNA过度表达，但其靶点尚不清楚。在一项研究中，研究者试图确定H19在甲状腺肿发展中的新靶点。通过相互作用能量计算，检查了NKX2-1 mRNA与H19 lncRNA之间的相互作用。在H19 lncRNA靶位点上发现了假定的microRNAs，这些microRNAs对NKX2-1具有最高的亲和力。通过RNAseq数据分析基因表达的组织特异性。在甲状腺切除手术中从18个甲状腺肿和18个正常组织中取样。使用特定引物通过RT-qPCR确定NKX2-1的表达。NKX2-1与H19的相互作用由六个局部碱基配对连接组成，最大能量为-20.56 kcal/moL。特别是，显示与H19结合具有最高亲和力的序列与has-miR-1827结合到NKX2-1的结合位点重叠。研究发现，NKX2-1仅在正常甲状腺组织中与H19共表达。与相邻的正常组织相比，结节性甲状腺肿组织中的NKX2-1显著过度表达（相对表达=1.195，p=0.038）。NKX2-1已被确定为H19 lncRNA的假定靶点，在结节性甲状腺肿组织中显著过度表达[2]。

先天性甲状腺功能减退症（CH），归因于甲状腺发育不良（TD），在墨西哥人群中具有异常高的患病率，但其原因尚不清楚。NKX2-1作为候选基因，在122名无亲缘关系的墨西哥CH/TD患者中进行了自动化Sanger测序。虽然这项研究包括迄今为止分析过的与TD相关的CH患者中NKX2-1的最大数量，但没有检测到致病性变异；仅确定了三种良性多态性变化。这些结果表明，NKX2-1不是CH或其在墨西哥人中高患病率的主要原因。这项工作确定了先前发表的三篇关于NKX2-1变异的误注释[3]。

T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）是不成熟的淋巴样肿瘤，定位于骨髓、纵隔、中枢神经系统和淋巴器官。它们占儿科和约25%的成人急性淋巴细胞白血病（ALL）病例的10-15%。它是一种广泛异质性的疾病，由随时间获得的多种遗传异常的共发引起，一旦积累，就会导致完全的白血病。反复受影响的基因调节关键细胞过程，如细胞周期（CDKN1B、RB1、TP53）、信号转导（RAS通路、IL7R/JAK/STAT、PI3K/AKT）、表观遗传学（PRC2成员、PHF6）和蛋白质翻译（RPL10、CNOT3）。NOTCH1和CDKN2A发挥着重要作用，因为它们在超过一半的病例中发生了改变。NOTCH1信号的激活影响胸腺细胞的谱系特化和发育，而CDKN2A的杂合子不足/失活则促进细胞周期进程。在反复涉及的致癌基因中，T细胞特异性转录因子发挥着重要作用，其表达失调干扰了正常胸腺细胞的发育，并导致阶段特异性分化停滞。因此，TAL和/或LMO的失调是成熟表型（sCD3阳性）的T-ALL的典型特征，而TLX1、NKX2-1或TLX3的失调是皮质T-ALL（CD1a阳性）的典型特征；HOXA和MEF2C则在早期T细胞前体（ETP；不成熟表型）和早期T-ALL的子集中过表达。在未成熟的T-ALL中，导致BCL11B转录失调的基因组改变，确定了特定的遗传亚组。尽管全面的细胞遗传学和分子研究揭示了T-ALL的遗传背景，但目前尚未在T-ALL的诊断过程中采用生物标志物，并且只有少数研究评估了其临床意义。在这篇综述中，我们将重点关注定义特定白血病发生途径的反复T-ALL异常，以及可以用作诊断生物标志物的致癌基因/抑癌基因。此外，我们还将讨论如何利用T-ALL的复杂基因组谱来应对和测试创新/靶向治疗方案[4]。

NANCI（Nkx2.1相关非编码基因间RNA）-Nkx2.1基因二聚体在缓冲Nkx2.1表达、肺上皮细胞身份和组织稳态方面发挥着重要作用。在这个位点内，Nkx2.1直接抑制NANCI，而NANCI则以顺式作用促进Nkx2.1的转录。虽然单独缺乏NANCI不会对肺发育产生不利影响，但NANCI和Nkx2.1同时发生杂合子突变会导致持续的Nkx2.1缺乏和肺上皮细胞重新编程为后端内胚层命运。这种NANCI-Nkx2.1基因二聚体的破坏导致围产期先天免疫反应缺陷、组织损伤和成人肺的进行性退化。这些数据指向了一种机制，其中lncRNAs在lncRNA-TF基因二聚体位点中充当稳压器，缓冲TF表达，从而在发育和出生后稳态中维持组织特异性细胞身份[5]。

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，肺腺癌是最常见的肺癌亚型。在所有肺腺癌中，最常见的亚型通过从非典型腺瘤样增生（AAH）到原位腺癌（AIS），再到微浸润性腺癌（MIA），再到明显的具有鳞状生长模式的浸润性腺癌的肿瘤发生和进展发展而来。这种逐步发展得到了这些肿瘤的 clinicopathological 和分子特征的支持。在2015年世界卫生组织分类中，AAH和AIS都被定义为前侵袭性病变，而MIA被确定为早期侵袭性腺癌，如果完全切除，则不会复发。最近的研究检查了肺腺癌肿瘤发生的分子特征和进展。EGFR突变的腺癌通常通过多步进展发展而来。KRAS或BRAF突变的腺癌的肿瘤发生可能涉及表观遗传改变和激酶失活突变，因为致癌基因诱导的衰老似乎降低了KRAS或BRAF突变的腺癌的多步进展频率。这篇综述总结了早期肺腺癌肿瘤发生和进展的当前知识，特别关注其 clinicopathological 特征及其与驱动突变（EGFR、KRAS和BRAF）的关联，以及其分子发病机制和进展[6]。

由于碘浓度和过氧化物酶活性的相似性，脊椎动物的甲状腺被认为起源于无脊椎脊索动物的咽鳃，尽管它是用于水生悬浮喂养的腺体（粘液产生）器官。在具有咽鳃的脊索动物中，尾索动物是研究脊椎动物特征的进化研究模型。尾索动物肠尾肠形成具有腺体和甲状腺相关元素特定成分的咽鳃，这些成分的分子标记已被鉴定。由于我们之前研究了尾索动物Oikopleura dioica中的简单咽鳃，因此在本研究中通过TALEN介导的基因敲除干扰了Ciona Nkx2-1和FoxE的表达，以阐明复杂尾索动物咽鳃的共有和/或不同特征。Ciona Nkx2-1和FoxE的敲除对发育中的咽鳃的形态产生了不同的影响。Nkx2-1的敲除消除了腺体和甲状腺分化标记基因的表达，例如vWFL1、vWFL2、CiEnds1、TPO和Duox，而FoxE的敲除消除了分化标记基因TPO和CiEnds1的表达。在Nkx2-1和FoxE敲除幼体的发育不良咽鳃中，支持元件相关的Pax2/5/8a、Pax2/5/8b、FoxQ1和β-管蛋白的表达持续存在。尽管尾索动物特异性CiEnds1的基因调控尚不清楚，但这些结果为了解脊椎动物甲状腺和尾索动物咽鳃的进化提供了见解[7]。

先天性甲状腺功能减退症（CH）在婴儿中相对常见，如果未及时诊断和治疗，可能会对神经系统发育产生灾难性后果。CH与编码负责甲状腺发育的转录因子的基因中的遗传变化相关，包括NK2同源框1（NKX2.1）基因中的突变，该基因编码甲状腺转录因子-1（TTF-1）。尽管CH在儿科人群中经常观察到，但对导致这种疾病的遗传因素和分子机制的了解仍然有限。通过聚合酶链反应（PCR）、单链构象多态性（SSCP）和直接DNA测序对75名CH儿科患者的NKX2.1基因序列进行了研究。在NKX2.1基因的第3个外显子中发现了四个错义杂合子变异，包括三个新的错义变异，即c.708A>G，p.Gln202Arg；c.713T>G，p.Tyr204Asp；c.833T>G，p.Tyr244Asp，以及先前报道的变异rs781133468（c.772C>G，p.His223Gln）。重要的是，这些变异发生在TTF-1 DNA结合域中高度保守的残基上，并且通过生物信息学分析预测会改变蛋白质结构，可能会改变蛋白质功能。这些结果表明，NKX2.1基因中的核苷酸变化可能有助于CH的发病机制[8]。

肺癌的主要驱动突变，EGFR突变和EML4-ALK融合，主要在末端呼吸单位（TRU）型肺腺癌中检测到，这些腺癌通常表现出鳞状和/或乳头状模式，但很少与实性或浸润性粘液形态相关。为了阐明非TRU型肺癌中的关键遗传事件，研究者对43例基于形态学的非TRU型肺腺癌（17例腺泡状、9例实性、2例肠腺癌和15例具有粘液形态的腺癌）进行了全外显子测序。分析确定了TP53（16/43，37.2%）、KRAS（13/43，30.2%）和NKX2-1/TTF-1（7/43；16.3%）作为前三名显著突变基因，而EGFR突变在这组中很少见（1/43，2.3%）。发现了8个NKX2-1/TTF-1突变（五个移码、两个无义和一个错义），其中一个病例具有两个不同的NKX2-1/TTF-1突变（一个错义和一个移码）。使用NK2同源框1（NKX2-1）/甲状腺转录因子1（TTF-1）突变体的功能测定表明，它们都没有保留作为转录因子的活性。组织学上，浸润性粘液腺癌占NKX2-1/TTF-1突变的绝大多数（五例），以及一个肠腺癌和一个腺泡状腺癌。免疫组化显示，队列主要分为TTF-1阳性/肝细胞核因子4-α（HNF4-α）阴性和TTF-1阴性/HNF4-α阳性组。NKX2-1/TTF-1突变仅发现于后者，其中胃肠道标记物，粘蛋白5AC和细胞角蛋白20，经常表达。亚硫酸氢盐测序显示，NKX2-1/TTF-1基因体在NKX2-1/TTF-1阴性病例中高度甲基化，包括那些没有NKX2-1/TTF-1突变的病例。NKX2-1/TTF-1的遗传或表观遗传失活可能在非TRU型肺腺癌的发生和异常分化中发挥关键作用[9]。

肺泡是仅存在于空气呼吸生物体中的，从多能干细胞（PSCs）中生成一直具有挑战性，部分原因是缺乏提供必要发育路线图的模型系统。研究者报告了从人PSCs中生成肺泡上皮II型细胞（AEC2s），即肺泡的必需前体，从内胚层前体中产生。使用多色荧光报告基因系，研究者跟踪和纯化了人SFTPC+肺泡前体，这些前体在Wnt和FGF信号的刺激下从内胚层前体中产生。纯化的PSC衍生的SFTPC+细胞在3D培养中形成单层上皮“肺泡球体”，无需间充质支持，表现出自我更新能力，并表现出AEC2的其他功能能力。从携带纯合子表面活性剂突变（SFTPB121ins2）的患者中获得的PSCs中，基于CRISPR的基因校正恢复了AEC2中的表面活性剂处理。因此，PSC衍生的AEC2s为疾病建模和未来远端肺的功能性再生提供了一个平台[10]。

综上所述，Nkx2-1基因在多个生物学过程中发挥着关键作用，包括甲状腺、肺和脑的发育和功能。Nkx2-1的突变与多种疾病相关，包括甲状腺功能减退症和肺癌。此外，Nkx2-1在维持肺上皮细胞身份和组织稳态方面发挥着重要作用。Nkx2-1的研究有助于深入理解基因表达和发育的调控机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。