Smn1-KO 基因敲除小鼠

Smn1，即生存运动神经元基因1，是脊髓性肌萎缩症（SMA）的致病基因。SMA是一种常染色体隐性遗传病，以脊髓运动神经元的变性导致肢体和躯干的进行性无力以及肌肉萎缩为特征。该病是导致儿童死亡的最常见遗传原因之一，其携带者频率为1/50。SMA的临床表现非常多样化，根据发病年龄和临床病程，患者被分为I型、II型和III型SMA。所有三种类型的SMA均由Smn1基因突变引起。在人类染色体5q13上存在两个几乎相同的拷贝，Smn1和Smn2。Smn1基因的纯合缺失是导致SMA的唯一原因，而Smn2基因的纯合缺失在约5%的正常对照中存在，但并无临床表现。

大约96%的SMA患者显示Smn1基因的突变，而4%的患者与5q13基因座无关联。在5q13基因座相关的SMA患者中，96.4%的患者表现出Smn1基因外显子7和8或仅外显子7的纯合缺失，而3.6%的患者表现出一种复合杂合性，其中一个染色体上存在细微突变，另一个染色体上存在缺失/基因转换。迄今为止，已描述了23种不同的细微突变，其中Y272C错义突变最为常见，占20%。由于这种统一的突变谱，直接分子遗传测试对于大多数SMA患者来说是一种简单且快速的分析方法。直接测试杂合子虽然并非易事，但由于约4%的个体每个染色体上存在两个Smn1拷贝，因此这种测试存在一定的局限性。Smn2拷贝数会影响SMA的临床表型，但不应用于预测SMA的严重程度[1]。

SMA是由于Smn1基因的缺失或突变导致的，而Smn2基因保留了下来。人类种群中Smn1和Smn2的拷贝数各不相同，Smn2拷贝数与SMA严重程度呈负相关。目前SMA的治疗方法主要集中于提高Smn2的表达和选择性剪接，以增加SMN蛋白的数量。最近的研究表明，并非所有的Smn2或Smn1基因都是等同的，Smn基因在基因组水平上存在高度的异质性。由于SMA现在是一种可治疗的疾病，Smn2是主要的治疗靶点，因此，全面了解Smn基因的基因组异质性，包括由基因转换事件产生的杂交Smn1-Smn2基因以及Smn基因的部分缺失，对于疾病表型和治疗效果至关重要[2]。

在Smn1缺失的小鼠骨骼肌模型中，发现功能障碍的线粒体积累。Smn缺失导致线粒体和溶酶体基因的表达下调。尽管标记线粒体自噬的蛋白质水平升高，但Smn1敲除肌肉中出现了形态异常的线粒体，其复合体I和IV活性和呼吸功能受损，并产生了过多的活性氧。通过移植能够纠正Smn敲除小鼠肌病表型的羊水干细胞，恢复了线粒体的形态和线粒体基因的表达。因此，针对SMA中肌肉线粒体功能障碍的治疗可能补充现有的基因疗法[3]。

通过长读PacBio HiFi测序技术，开发了一种称为Paraphase的informatics方法，用于识别全长Smn1和Smn2单倍型，确定基因拷贝数，并使用长读PacBio HiFi数据调用单倍型。Paraphase对Smn1和Smn2拷贝数的调用与正交方法高度一致（Smn1为99.2%，Smn2为100%）。在5个不同种族群体的438个样本中，应用Paraphase进行全人群单倍型分析，确定了主要的Smn1和Smn2单倍型组，并通过家系分析描述了它们的共分离。在非洲人群中，确定了两种Smn1单倍型，它们形成了一种常见的两拷贝Smn1等位基因。如果一个个体具有两个Smn1拷贝并测试出这两种单倍型，则为沉默携带者的风险为88.5%，这显著高于目前使用的标记（1.7%-3.0%）。除了简单的拷贝数测试之外，Paraphase还可以检测致病性变异，并通过单倍型的统计分相，使潜在的基于单倍型的沉默携带者筛选成为可能。未来对更大人群数据的分析将允许识别更多样化的单倍型和沉默携带者的遗传标记[4]。

SMN1和SMN2（生存运动神经元）编码相同的蛋白质。一个关键问题是为什么只有Smn1基因的纯合缺失，而不是Smn2基因，会导致SMA。对SMN1/SMN2杂交基因的转录本和一种新的SMN1突变进行分析表明，疾病的表型与外显子7的跳跃直接相关。先前的研究已经报道，外显子跳过的SMNDelta7产物部分地丧失了自结合能力，而SMN的自寡聚化与临床严重程度相关。为了系统地评估Smn1和Smn2之间五个核苷酸差异对外显子7选择性剪接的影响，构建了一系列SMN小基因并将其转染到培养细胞中，对其转录本进行了表征。在这些核苷酸差异中，外显子7在密码子280处的C-to-T转换，这是一种翻译沉默变异，对于决定外显子7的选择性剪接是必要和充分的。因此，Smn2无法完全补偿Smn1并防止SMA的原因是由于一个核苷酸交换（C/T），它减弱了一个外显子增强子的活性。这些发现揭示了SMA的性质和发病机制分子遗传学基础，并展示了一种新的疾病机制。由于SMA患者保留了Smn2等位基因，因此针对防止外显子7跳跃的治疗可能会改变临床结果[5]。

在基因治疗方面，使用密码子优化的hSMN1转基因和hSMN1基因衍生的启动子，在小鼠中实现了对SMA的改进基因治疗。Onasemnogene abeparvovec（Zolgensma®）是一种经批准的腺相关病毒（AAV）载体基因疗法，用于治疗患有SMA的婴儿，然而，在动物和患者接受治疗后均观察到不良事件。该构建体包含一个由强效的巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白（CMVen/CB）启动子驱动的天然人类生存运动神经元1（hSMN1）转基因，提供高水平的SMN在全身组织中的表达。开发了一种第二代AAV9基因疗法，表达由hSMN1基因衍生的启动子驱动的密码子优化的hSMN1转基因。该载体在严重SMA小鼠模型的中枢神经系统和主要系统器官中恢复了接近生理水平的SMN表达。与第二代载体与一个设计上与onasemnogene abeparvovec相同的基准载体进行的头对头比较中，第二代载体在SMA小鼠模型中显示出更好的安全性并提高了疗效[6]。

SMN1基因的复制与散发性ALS相关。在一项包括847名ALS患者和984名对照的大型人群遗传关联研究中，使用多重连接依赖探针扩增（MLPA）分析确定了SMN1和SMN2的拷贝数，并检查了它们对疾病易感性和疾病进程的影响。此外，还测序了SMN基因，以确定SMN突变是否在ALS患者中更为普遍。与先前研究结果的荟萃分析显示，SMN1复制与ALS易感性相关（优势比[OR] 1.85，95%置信区间[CI] 1.18-2.90，p = 0.008）。SMN1缺失和SMN2拷贝数状态与ALS无关。SMN1或SMN2拷贝数变异对生存期或疾病发病年龄没有影响。未发现ALS患者中SMN点突变的富集。这些数据为常见的SMN1复制在ALS中的作用提供了强有力的证据，并提出了有关疾病机制的新问题[7]。

在2023年进行的扩大新生儿筛查项目中，分析了从俄罗斯联邦的1,227,130名新生儿（占1,256,187名新生儿）中获得的样本，以检测5q脊髓性肌萎缩症（5q SMA）。在基于第一阶段筛查结果形成的253个样本风险组中，5个样本在通过多种筛查方法和定量MLPA（作为参考）获得的检查结果之间存在差异。这种差异是由Smn1基因中存在c.835-18C>T内含子变异或c.842G>C p.(Arg281Thr)错义变异引起的，这两个变异都位于与连接和实时PCR探针的互补序列中。三个新生儿具有c.835-18C>T变异，与Smn1基因外显子7-8的缺失呈复合杂合状态，一个具有两个Smn1基因拷贝的新生儿具有相同的变异呈杂合状态，一个新生儿同时具有两个变异-c.835-18C>T和c.842G>C p.(Arg281Thr)-呈复合杂合状态。对这些变异进行了额外的检查，包括家系中的分离分析、人群队列中的携带者分析和RNA分析。根据ACMG标准，c.835-18C>T内含子变异应被归类为可能良性，而c.842G>C p.(Arg281Thr)错义置换为临床意义不明确的变异。所有五个先证者都在动态监测之下。在新生儿或1年的随访期间，这些新生儿中均未检测到5q SMA的症状[8]。

综上所述，Smn1基因的突变或缺失是导致SMA的关键因素。Smn1和Smn2基因的拷贝数变异和点突变在SMA的发病机制中发挥重要作用。目前的治疗方法主要集中在提高Smn2的表达和选择性剪接，以增加SMN蛋白的数量。未来的研究需要进一步探索Smn基因的基因组异质性，以及开发更有效和安全的基因治疗方法。