Rlbp1-KO 基因敲除小鼠

RLBP1，即Retinaldehyde-binding protein 1，编码一种名为细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP）的视觉循环蛋白。CRALBP的主要功能是结合11-cis-视黄醇，增强视黄醇异构酶RPE65的异构酶活性，并促进11-cis-视黄醇氧化为11-cis-视黄醛。此外，CRALBP还能维持11-cis-构型，并保护视网膜免受不希望的视黄醛活性影响。RLBP1的突变会导致一种常染色体隐性遗传性视网膜变性，主要表现为视网膜色素上皮层萎缩和感光细胞变性。

在遗传学研究方面，全基因组关联研究（GWAS）已发现34个基因座与年龄相关性黄斑变性（AMD）有关。有研究对453例AMD患者和对照者进行了视网膜转录组分析，并整合了视网膜转录组和超过900万个常见单核苷酸多态性（SNPs）的基因型数据，进行了表达数量性状位点（eQTL）分析。结果显示，cis-eQTL分析鉴定出10,474个受遗传调控的基因，其中4,541个eQTLs仅在视网膜中发现。通过整合AMD-GWAS和eQTLs分析，确定了六个已报道的位点上的可能靶基因。此外，转录组关联分析（TWAS）在Bonferroni校正后还发现了三个额外的基因，包括RLBP1、HIC1和PARP12。这些研究扩展了AMD的遗传景观，并建立了Eye Genotype Expression（EyeGEx）数据库，为多因素眼部性状的GWAS后解释提供了资源[1]。

在临床研究方面，有研究对22例分子学确认的RLBP1相关视网膜病变患者和5例RDH5相关视网膜病变患者进行了回顾性单中心队列研究。研究发现，两组患者的中位年龄分别为44.6岁和36.9岁。两组患者的约80%眼睛都发现了黄斑萎缩。RLBP1基因型与较低的黄斑体积相关，比RDH5基因型低0.28 mm3。两组患者都发现黄斑体积有显著的年损失率，估计为-0.007 mm3/y，两组之间没有显著差异。此外，三名RLBP1基因型患者对视杆和视锥系统的功能有轻微损害，且无黄斑萎缩。这些发现有助于提高对患者预后判断的准确性，并有助于设计未来的干预试验[2]。

在自然史研究方面，有研究对45例患有由RLBP1基因突变引起的视网膜变性的患者进行了五年前瞻性自然史研究。研究发现，患者在基线时的最佳矫正视力（BCVA）范围从-0.2到1.3 logMAR，对比敏感度差，视野缺陷，中央黄斑厚度明显变薄。所有患者都出现了极长的暗适应视杆恢复时间，约6小时。这项自然史研究是首次对RLBP1 RD患者进行五年监测，结果显示，所有年龄组的患者都观察到了严重延迟的暗适应敏感性恢复，这可能是该疾病的特征性表现，也可能适合作为基因治疗疗效评估的指标[3]。

在动物模型研究方面，有研究通过分析一对RLBP1/CRALBP复合杂合突变的兄弟姐妹，扩展了受影响个体的表型，阐明了一种以前未报道的RLBP1/CRALBP携带者表型，并证明了受影响个体和Rlbp1/Cralbp-/-小鼠之间的一致性。研究发现，受影响个体在长时间暗适应后恢复了非记录性的视杆特异性视网膜电图（ERG）轨迹。在超广角眼底图像中，观察到了RLBP1/CRALBP相关疾病的典型放射状排列的点。光谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）显示感光细胞相关带内存在高反射异常。在短波长眼底自发荧光（SW-AF）图像中，斑点状高自发荧光和斑驳表明黄斑受累。在受影响个体及其无症状的携带父母中，定量眼底自发荧光（qAF）测量到的SW-AF强度降低，表明11-cis-视黄醛的长期供应受损，并提供了关于突变严重程度的信息。SD-OCT信号向脉络膜的过度透射以及近红外自发荧光（NIR-AF）的降低提供了视网膜色素上皮细胞（RPE）受累的证据。在Rlbp1/Cralbp-/-小鼠中，11-cis-视黄醛水平降低，qAF和NIR-AF强度降低，以及感光细胞丢失与受影响兄弟姐妹的临床表现一致。这些发现表明，RLBP1突变与RPE萎缩和感光细胞变性相关的进行性疾病有关。在无症状的携带者中，qAF揭示了以前未被发现的视觉循环缺陷[4]。

在基因治疗方面，有研究对21例具有RLBP1基因致病性变异的患者进行了回顾性队列研究。研究发现，最常见的表型是NFRCD，其中12名患者（8个家庭）为RLBP1第7至9个外显子的重复缺失，5名患者（4个家庭）具有双等位基因蛋白截断变异（2个新变异：p.Gln16*和p.Tyr251*）。2名姐妹携带p.Arg234Trp Bothnia变异和反义链中的无义变异，导致Bothnia营养不良。1名先证者携带p.Met266Lys Bothnia变异和反义链中的p.Arg121Trp，以及另1名携带p.Arg9Cys和p.Tyr111*组合的先证者，均表现为轻度视网膜点状白斑。根据双等位基因变异组合使用提出的稳健分类，首先应该确定RLBP1基因治疗的适用性。超过1200 μm的椭圆线宽度和超过130至150 μm的中央厚度，以及可检测到的椭圆线和交指线，应作为基因治疗的2个先决成像指标[5]。

此外，有研究通过将RLBP1基因的3-kb区域和5'-侧翼序列与增强型绿色荧光蛋白（GFP）cDNA连接，构建了转基因小鼠，以研究RLBP1启动子是否能在体内驱动Müller胶质基因的表达。研究发现，在出生时，视网膜祖细胞就开始表达GFP，Müller胶质在所有产后发育阶段和rd1视网膜中都显示出强烈的GFP表达。这些结果提供了体内驱动GFP表达的转录元件，可以用于在产后发育过程中可视化视网膜祖细胞，以及在健康或变性成人视网膜中可视化Müller胶质细胞[6]。

在糖尿病视网膜病变（DR）方面，有研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析了db/db和db/m小鼠的视网膜，以阐明DR的发病机制。研究发现，DR影响了细胞类型特异性基因，并改变了细胞间通讯。基于scRNA-seq结果，视网膜醛结合蛋白1（RLBP1）被研究作为DR的潜在治疗靶点。视网膜RLBP1表达在糖尿病中降低，其在Müller胶质细胞中的过表达可以减轻DR相关的神经血管变性。这些数据为糖尿病和正常条件下视网膜的详细分析提供了新的见解，揭示了可能被靶向以治疗DR和相关功能障碍的致病因素[7]。

最后，有研究对scAAV8-RLBP1的安全性进行了非临床评估。研究发现，在Rlbp1-/-小鼠中，以1 μL的体积给予3 × 107 vg的CPK850水平时，观察到最小有效剂量。安全性评估表明，对于两种Rlbp1基因型，OCT和病理分析都显示视网膜变薄，且剂量依赖性，在Rlbp1+/+和Rlbp1-/-小鼠之间没有观察到定性的差异。在一项非人灵长类动物研究中，检测到了RLBP1 mRNA的表达，并且观察到剂量依赖性的眼内炎症和视网膜变薄。炎症在一段时间内缓慢消退，并且在存在抗AAV8抗体的条件下没有恶化。在非人灵长类动物研究的啮齿类动物和卫星动物中评估了生物分布。该载体主要在眼部组织中检测到，在视神经、上丘和外侧膝状体中有低水平的分布，在上述组织之外的组织中有有限的分布。这些数据表明，可以安全地在临床试验中使用初始的亚视网膜剂量，约为3 × 107 vg/μL CPK850[8]。

综上所述，RLBP1是一种重要的视觉循环蛋白，其突变与视网膜变性相关，导致视网膜色素上皮层萎缩和感光细胞变性。RLBP1的研究不仅在遗传学、临床研究、自然史研究、动物模型研究、基因治疗和糖尿病视网膜病变等方面取得了重要进展，还为视网膜变性的治疗和预防提供了新的思路和策略。