Aff1-KO 基因敲除小鼠

AFF1，也称为AF4/FMR2家族成员1，是一种重要的基因，编码一个在超级延长复合物（SEC）中发挥中心支架蛋白作用的转录因子。AFF1在基因转录调控中发挥关键作用，参与调控多种生物学过程，包括细胞分化、发育和疾病发生。AFF1在多种疾病中发挥重要作用，包括急性淋巴细胞白血病（ALL）、急性髓系白血病（AML）和混合谱系白血病（MLL）。

KMT2A（也称为MLL）基因编码组蛋白赖氨酸特异性N-甲基转移酶2A，定位于11q23染色体上。KMT2A是急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）和混合谱系白血病（MLL）中常见的易位靶点。迄今为止，已鉴定出超过90个KMT2A融合伙伴，包括最常见的融合伙伴AFF1、MLLT1和MLLT3，它们编码调节表观遗传机制的蛋白质。KMT2A重排是ALL的一个独立的不良预后因素，而极少数KMT2A重排具有良好或中间的预后。KMT2A重排ALL影响超过70%的新诊断婴儿（<1岁）ALL病例，5-6%的儿科病例和15%的成人病例。KMT2A重排ALL的特征是高白细胞血症、相对较高的中枢神经系统（CNS）受累率、具有早期复发的侵袭性病程，以及早期复发导致的预后不良。融合和最终表型活动对疾病的确切途径仍然是研究的热点。未来的试验可以考虑包括靶向免疫治疗剂，并优先确定预后因素，从而减少对某些KMT2A ALL婴儿的治疗强度[1]。

KMT2A-AFF1融合蛋白通过直接结合并诱导抗凋亡因子BCL2和原癌基因MYC的异常过度表达来驱动白血病的发生。然而，单独研究直接结合并不能包含可能的网络产生的调节输出，包括基因的间接诱导抑制。为了更好地了解KMT2A-AFF1驱动的调节景观，研究人员集成了ChIP-seq、患者RNA-seq和CRISPR必要性筛选，以生成一个基因调控网络（GRN）模型。该GRN确定了几个关键的转录因子，如RUNX1，它们使用前馈环路（FFL）和级联基序调节KMT2A-AFF1下游的目标基因。在ALL和AML中，都存在一组核心节点，CRISPR筛选揭示了几个有助于调节对药物venetoclax反应的因素。使用我们的GRN，我们还确定了KMT2A-AFF1:RUNX1级联，该级联抑制CASP9，以及KMT2A-AFF1驱动的FFLs，它们通过组合转录因子活性调节BCL2和MYC。这说明了我们的GRN如何更好地将KMT2A-AFF1行为与下游通路联系起来，这些通路有助于白血病的发生，并可能预测介导药物反应的基因表达变化[2]。

KMT2A基因在染色体11q23上的重排，也称为MLL基因，在10%和5%的成人ALL病例和5%的儿童ALL病例中可以发现。最常见的易位基因是AFF1（以前称为AF4）、MLLT3（以前称为AF9）和MLLT1（以前称为ENL）。MLL重排ALL的发病率通常在婴儿出生后的前两年达到高峰，然后随着儿科/年轻成年阶段的下降而下降，直到年龄增加后再次上升。MLL重排ALL的特征是高白细胞血症、早期复发的侵袭性病程、相对较高的中枢神经系统（CNS）受累率和预后不良。MLL重排ALL细胞相对抵抗皮质类固醇（由于Src激酶诱导的annexin A2的磷酸化）和L-天冬酰胺酶治疗，但它们对阿糖胞苷化疗敏感（由于hENT1表达水平升高）。潜在的靶向治疗包括FLT3抑制剂、MEK抑制剂、HDAC抑制剂、BCL-2抑制剂、MCL-1抑制剂、蛋白酶体抑制剂、低甲基化剂、Dot1L抑制剂和CDK抑制剂。在这篇综述中，我们讨论了MLL重排ALL，重点关注临床表现、风险分层、耐药性和治疗策略，包括潜在的新的治疗靶点[3]。

新生儿白血病定义为在出生后的前28天内发生，并且大多数（如果不是全部）病例是先天性的。除了与唐氏综合征相关的短暂异常骨髓形成，这在本研究中不予考虑，新生儿白血病是罕见的。在三分之二的病例中，疾病表现为急性髓系白血病，通常具有单核细胞/单核细胞性特征。大多数其他病例是急性淋巴细胞白血病，特别是B谱系，但有些是混合表型或浆细胞样树突状细胞肿瘤。最常见的细胞遗传学/分子异常是t(4;11)(q21.3;q23.3)/KMT2A-AFF1，其次是t(1;22)(p13.3;q13.1)/RBM15-MKL1和t(8;16)(p11.2;p13.3)/KAT6A-CREBBP。常见的临床特征包括明显的肝脾肿大和高发生率的中枢神经系统受累，有时在骨髓疾病不存在的情况下。一个显著的特征是某些病例自发缓解的发生，特别是在t(8;16)相关的情况下。在这篇综述中，我们总结了新生儿白血病的临床、细胞遗传学和分子特征，并讨论了这些病例的临床管理[4]。

KMT2A-AFF1（MLL-AF4）由染色体易位t(4;11)形成，特异地出现在婴儿前B细胞急性淋巴细胞白血病中，是白血病发生的主要驱动因素。在这项研究中，建立了携带KMT2A-AFF1（IMSUTi002-A-2）的人诱导多能干细胞（hiPSC）系，该系具有同时诱导KMT2A-AFF1和EGFP的doxycycline诱导表达的能力。这种hiPSC可以成为理解婴儿白血病和白血病发生风险评估的强大模型[5]。

AFF1通过靶向TGM2转录抑制脂肪生成。AFF1作为超级延长复合物（SEC）的中心支架蛋白，调节基因转录。之前的研究表明，AFF1抑制人骨髓间充质干细胞（hMSCs）的成骨分化。然而，它在脂肪生成中的作用尚未阐明。hMSCs和3T3-L1前脂肪细胞被培养并诱导进行脂肪生成。应用小干扰RNA（siRNAs）以耗尽AFF1，同时使用表达HA-Aff1的慢病毒进行过表达。进行油红O染色、甘油三酯（TAG）定量、定量实时PCR（qPCR）、Western blot分析、免疫荧光染色、RNA测序（RNA-seq）分析和ChIP-qPCR。为了评估体内脂肪生成，将过表达Aff1的3T3-L1前脂肪细胞皮下注射到BALB/c裸鼠中。AFF1耗尽导致hMSCs和3T3-L1前脂肪细胞中的脂肪生成增强。在3T3-L1细胞中过表达Aff1导致脂肪生成减少，并降低体内脂肪组织的形成。在机制上，AFF1结合到Tgm2基因的启动子区域并调节其转录。Tgm2的过表达在很大程度上挽救了Aff1缺乏细胞的脂肪生成。这些数据表明，AFF1通过调节TGM2的转录来抑制脂肪生成[6]。

在KMT2A::AFF1（MLL::AF4）重排的白血病中，环状RNA（circRNAs）是白血病发生中的新兴分子参与者，是很有前途的治疗靶点。在与其他儿科B细胞前体（BCP）急性淋巴细胞白血病（ALL）相比更具侵袭性的KMT2A::AFF1重排白血病中，关于circRNAs的数据有限。在这项研究中，研究人员揭示了KMT2A::AFF1易位BCP-ALL婴儿患者的circRNA景观，显示白血病细胞中circRNA失调，主要是异常表达的circRNA。除了circHIPK3和circZNF609，这些circRNA大部分以前与ALL中的致癌行为相关，目前仍未被表征。体外功能缺失筛选确定了circFKBP5、circKLHL2、circNR3C1和circPAN3在KMT2A::AFF1 ALL中的致癌作用，其沉默影响了细胞增殖和凋亡。进一步的研究在一个扩展队列中揭示了这些致癌circRNA的显著相关表达，并推测了它们在常见调节网络中的潜在参与。此外，还发现circAFF1在一些HOXA KMT2A::AFF1 ALL病例中上调。总的来说，功能分析和患者数据揭示了致癌circRNA上调是维持KMT2A::AFF1 ALL中恶性细胞表型的一个相关机制[7]。

在成人BCR-ABL1阴性B-ALL中，分子分类提高了风险评估。基因组分类提高了儿科，但不是成人B谱系急性淋巴细胞白血病（B-ALL）的风险分配。国际UKALLXII/ECOG-ACRIN E2993（#NCT00002514）试验纳入了1229例青少年/成人B-ALL患者（年龄14至65岁）。尽管93%的患者实现了缓解，但41%的患者在平均13个月（范围，28天至12年）时复发。5年总生存率（OS）为42%（95%置信区间，39，44）。转录组测序、基因表达谱分析、细胞遗传学和融合聚合酶链反应使282例患者样本的基因组亚型得以分类，其中264例符合试验条件，占E2993患者的64.5%。在具有结果数据的患者中，29.5%的患者具有良好结果（5年OS为65%至80%），被认为是标准风险（DUX4易位[9.2%]、ETV6-RUNX1/-样[2.3%]、TCF3-PBX1[6.9%]、PAX5 P80R[4.1%]、高超二倍体[6.9%]）；50.2%的患者具有高风险基因型，5年OS为0%至27%（Ph样[21.2%]、KMT2A-AFF1[12%]、低超二倍体/近单倍体[14.3%]、BCL2/MYC易位[2.8%]）；20.3%的患者具有中间风险基因型，5年OS为33%至45%（PAX5alt[12.4%]、ZNF384-R/-样[5.1%]、MEF2D易位[2.8%]）。IKZF1改变发生在86%的Ph样患者中，TP53突变发生在低超二倍体（54%）和BCL2/MYC易位（33%）的患者中，但它们与结果无关。在根据年龄和白细胞计数被认为是高风险的患者中，40%携带与标准风险或中间风险结果相关的亚型定义性基因改变。我们确定了DUX4易位、PAX5 P80R、ZNF384-R/-样和Ph样基因型的独特免疫表型特征。在单一试验中，这些数据表明，基因组分析在成人B-ALL队列中的预后重要性，这可能会转化为未来的治疗益处[8]。

在暴露于致突变剂后不久，哺乳动物细胞会抑制转录，以防止与修复机制发生冲突，并建立适当的DNA损伤反应。然而，早期转录抑制的机制尚不清楚。在这篇报告中，研究人员表明，p300对超级延长复合物（SEC）亚单位AFF1的位点特异性乙酰化减少了其与其他SEC成分的相互作用，并损害了P-TEFb介导的RNA聚合酶II羧基末端结构域的磷酸化，无论是在体外还是体内。野生型AFF1的重新表达，而不是一个乙酰化模拟突变体，恢复了AFF1敲低细胞中SEC成分的募集和目标基因的表达。生理上，研究人员表明，在致突变剂暴露后，p300介导的AFF1乙酰化是动态的，并与伴随的全局转录下调密切相关，并且可以通过过表达一个乙酰化缺陷的AFF1突变体来逆转。因此，研究人员描述了p300介导的乙酰化在致突变应激过程中动态转录调控的一个机制[9]。

缺氧响应的转录延长控制。从启动子邻近区域释放暂停的RNA聚合酶II（RNAPII）的释放受到严格控制，以确保基因表达的适当调节。已知延长因子PTEF-b通过其细胞周期蛋白依赖性激酶成分CDK9磷酸化RNAPII的羧基末端结构域来释放暂停的RNAPII。然而，各种包含PTEF-b/CDK9的RNA聚合酶II相关大分子复合物在信号和应激特异性中的作用尚不清楚。在这项研究中，研究人员确定了CDK9复合物，该复合物对缺氧响应的转录延长是必不可少的。与之前的报道相反，研究数据表明，包含BRD4但不包含AFF1/4的CDK9复合物对于缺氧应激响应是必不可少的。研究人员证明，BRD4的溴结构域（BET）对于在缺氧激活基因上释放暂停的RNAPII是不必要的，并且JQ1对BET的抑制不足以损害缺氧基因反应。在机制上，研究人员证明BRD4的羧基末端区域对于聚合酶相关因子1复合物（PAF1C）的募集到缺氧反应基因上是必需的，以建立一个具有延长能力的RNAPII复合物。使用小分子抑制剂（iPAF1C）破坏PAF1C损害了BRD4介导的RNAPII释放。总而言之，这些结果为控制缺氧响应转录延长机制提供了见解[10]。

综上所述，AFF1是一种重要的基因，编码一个在超级延长复合物（SEC）中发挥中心支架蛋白作用的转录因子。AFF1在基因转录调控中发挥关键作用，参与调控多种生物学过程，包括细胞分化、发育和疾病发生。AFF1在多种疾病中发挥重要作用，包括急性淋巴细胞白血病（ALL）、急性髓系白血病（AML）和混合谱系白血病（MLL）。此外，AFF1还参与缺氧应激响应和DNA损伤反应的调控。AFF1的研究有助于深入理解基因转录调控的生物学功能和疾病发生机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。