Gdi1-KO 基因敲除小鼠

Gdi1基因编码αGDI蛋白，这是一种控制小GTP酶循环的蛋白，被认为协调囊泡转运。人类GDI1基因突变与智力障碍（ID）有关。在敲除Gdi1基因的小鼠模型中，记录了工作记忆和联想短期记忆受损。如果αGDI表达在神经元中受到限制，这种认知表型会恶化。然而，星形胶质细胞（提供神经胶质细胞稳态的关键细胞）是否通过有氧糖酵解支持神经元，并参与这种认知障碍尚不清楚[1]。星形胶质细胞通过有氧糖酵解支持神经元，参与认知障碍的机制[1]。在Gdi1敲除小鼠的星形胶质细胞中，糖酵解酶的表达发生了显著变化。与野生型小鼠相比，Gdi1敲除小鼠的脑组织中葡萄糖摄取增加，与FRET测量确定的促进葡萄糖摄取一致。在星形胶质细胞中敲除Gdi1的小鼠中，记录了工作记忆的选择性和显著受损，这可以通过2-脱氧葡萄糖注射抑制糖酵解来挽救。这些结果揭示了一种新的星形胶质细胞参与的神经发育障碍机制，并为针对有氧糖酵解的治疗提供了新的机会[1]。

X连锁智力障碍（XLID）是一种异质性障碍，迄今为止，已有超过90个基因突变与XLID有关。在一个德国大家族中，受影响的男性家族成员患有非综合征性智力障碍，即他们没有异常的身体测量或其他任何显著的临床症状。分子遗传分析显示GDI1基因发生移码突变（c.1185_1186delAG；Ser396ProfsX15），该突变与疾病共分离。GDI1编码GDP解离抑制因子α（αGDI），一种参与调节Rab GTPases活性的蛋白。迄今为止，仅有三个家族报告了GDI1突变。目前家族不仅扩大了GDI1突变的范围，还强调了在具有非特异性表型的ID患者中平行检测所有已知基因的必要性[2]。

β-淀粉样蛋白（Aβ）诱导的神经毒性是阿尔茨海默病（AD）的一个机制。这项研究重点关注GDI1在Aβ诱导的神经毒性中的作用。来自GEO数据库的AD相关数据集GSE140829、GSE63061、GSE36980和GSE60360的数据被下载并确定了常见的差异表达基因（coDEGs）。通过RT-qPCR分析了AD患者血清中GDI1的mRNA水平。ROC曲线评估了诊断价值。Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞被用来构建AD细胞模型。CCK-8、流式细胞术和ELISA测定用于分析细胞活力、凋亡和炎症因子的浓度。KEGG富集被用来分析AD中GDI1靶点的信号通路。GEO数据库确定了包括GDI1在内的coDEGs。GDI1在AD患者的血清中普遍升高，以及在Aβ诱导的SH-SY5Y细胞中。GDI1有77.97%的灵敏度和84.44%的特异性来识别AD患者。Aβ诱导细胞活力降低、凋亡增加和炎症细胞因子过度分泌，但这些都被降低的GDI1部分减弱。此外，GDI1相互作用的基因和AD靶基因在细胞吞噬作用和MAPK信号通路中共富集。GDI1升高是AD的潜在诊断生物标志物，并且抑制GDI1可以减轻AD中的Aβ诱导的神经毒性。这项研究为AD的治疗提供了新的视角[3]。

克鲁维酵母和毕赤酵母的GDI1基因的核苷酸序列分别为2.8kb和2.9kb片段，分别编码445和447个氨基酸残基的多肽。这两个序列与已知酵母和其他真核生物的GDP解离抑制剂高度同源。它们完全补充了S. cerevisiae sec19-1突变[4]。

GTP结合蛋白Sec4/Ypt/rab家族调节真核细胞中不同的囊泡转运事件。我们从酵母S. cerevisiae中克隆了GDI1，这是一个与牛rab GDI（GDP解离抑制因子）同源的必需同源基因。类似于牛蛋白，纯化的Gdi1p减慢了GDP从Sec4p的解离，并释放了与GDP结合的Sec4p形式从酵母膜中。在活体内耗尽Gdi1p导致Sec4p可溶性池的丧失，并抑制分泌途径的多个阶段的蛋白质转运。互补分析表明GDI1是sec19-1的等位基因。这些结果证明Gdi1p在膜转运中发挥重要作用，并与Gdi1p在Sec4/Ypt/rab家族蛋白从其靶膜返回到其囊泡池中的再循环中的作用一致[5]。

骨形成蛋白1（ECM1）已被报道与骨形成分化密切相关。在本研究中，我们构建了基于敲除的ECM1敲除和ECM1a过表达的U2OS细胞系，并通过测序确定了目标miRNA（miR-1260b）。miR-1260b的过表达促进了U2OS和MG63细胞的骨形成分化，如碱性磷酸酶（ALP）活性、基质矿化以及Runt相关转录因子2（RUNX2）、骨桥蛋白（OPN）、胶原蛋白I（COL1A1）和骨钙素（OCN）蛋白表达的升高，而miR-1260b的低表达则产生相反的效果。此外，与无OP患者相比，OP患者的miR-1260b表达降低。接下来，我们通过TargetScan和miRDB预测了miRNA的目标基因，发现miR-1260b通过直接结合其3'-非翻译区负向调节GDP解离抑制因子1（GDI1）。随后的实验表明，GDI1的过表达降低了ALP活性和钙沉积，减少了RUNX2、OPN、COL1A1和OCN的表达水平，并逆转了miR-1260b对骨形成分化的影响。总之，本研究表明，ECM1相关的miR-1260b通过靶向GDI1促进U2OS和MG63细胞的骨形成分化。因此，这项研究对骨质疏松症的治疗具有重要意义[6]。

RAB-GDP解离抑制因子1（GDI1）功能丧失突变导致一种非特异性的X连锁智力障碍（XLID），其中唯一的临床特征是认知障碍。GDI1患者在特定方面的执行功能和条件反应受损，这些功能由额叶-纹状体回路控制。Gdi1-null小鼠的分子和行为的先前特征表明，海马体和皮质突触囊泡的总数/分布以及海马体短期突触可塑性发生改变，并存在记忆缺陷。在这项研究中，我们使用了具有高度翻译有效性的认知协议，针对人类条件下的额叶-纹状体回路功能，如注意力和刺激选择能力，以逐步提高复杂度。我们之前已经表明，Gdi1-null小鼠在由厌恶程序评估的海马体依赖性联想学习中的一些形式中受损。在这里，我们使用奖赏性条件程序进一步研究了由额叶-纹状体系统维持的联想学习缺陷。我们报告说，Gdi1-null小鼠在注意力和联想学习过程中受损，这是XLID患者观察到的认知障碍的关键部分[7]。

使用小鼠模型和人诱导多能干细胞衍生的巨噬细胞（hiMGL），通过基因改造产生最相反的稳态（TREM2敲除）和疾病相关（GRN敲除）状态，我们确定了巨噬细胞活动依赖的标记物。非靶向质谱用于识别Grn-和Trem2敲除小鼠的巨噬细胞和脑脊液（CSF）中的蛋白质组变化。此外，我们还分析了GRN-和Trem2敲除hiMGL及其条件培养基的蛋白质组。候选标记蛋白在两个独立的病患队列中进行了测试，分别是ALLFTD队列（GRN突变携带者与非携带者）以及来自EMIF-AD MBD研究的蛋白质组数据集。我们在小鼠巨噬细胞和CSF中，以及hiMGL细胞裂解物和条件培养基中，确定了Grn-和Trem2敲除小鼠的蛋白质组变化。为了进一步验证，我们分析了杂合GRN突变携带者患额颞叶痴呆（FTD）的CSF蛋白质组。我们确定了六个蛋白（FABP3、MDH1、GDI1、CAPG、CD44、GPNMB）作为巨噬细胞激活的潜在指标。此外，我们还证实了其中三个蛋白（FABP3、GDI1、MDH1）在阿尔茨海默病（AD）患者的CSF中显著升高。值得注意的是，这些标记物中的每一个都将淀粉样蛋白阳性的轻度认知障碍（MCI）病例与淀粉样蛋白阴性个体区分开来。这些候选蛋白反映了巨噬细胞活动，可能与监测临床实践中巨噬细胞反应和临床试验中调节巨噬细胞活性和淀粉样蛋白沉积相关。此外，在AD队列中发现这三个标记物区分了淀粉样蛋白阳性和阴性MCI病例，这表明这些蛋白与对种子淀粉样蛋白的早期免疫反应相关。这与我们在显性遗传阿尔茨海默病网络（DIAN）队列中的先前发现一致，其中可溶性TREM2在症状出现前21年就开始增加。此外，在淀粉样蛋白生成的动物模型中，种子淀粉样蛋白的传播受到生理活性巨噬细胞的限制，进一步支持了它们早期的保护作用。我们主要候选蛋白的一些生物学功能（FABP3、CD44、GPNMB）也进一步强调了脂质代谢失调可能是神经退行性疾病的共同特征[8]。

Rab GDP解离抑制因子（GDI）是进化上保守的蛋白质，在循环Rab GTPases中发挥重要作用，这些GTPases对于通过分泌途径的囊泡转运是必需的。我们在两个患有X连锁非特异性智力障碍的家庭中发现了GDI1基因（编码uGDI）的突变。其中一个突变导致非保守替代（L92P），减少了RAB3A的结合和循环。第二个突变是一种无义突变。我们的结果表明，神经元中的功能性和发育性改变可能导致GDI1突变后学习能力的严重损害，这强调了GDI1在人类智力和学习能力发展中的关键作用[9]。

LRRK2基因的致病性功能获得性突变导致帕金森病（PD），其特征是致残的运动和非运动症状。LRRK2介导的某些RAB GTPases的磷酸化增加与PD发病机制有关。我们发现，表达超活性LRRK2-p.R1441H的iPSC衍生的人神经元（iNeurons）中RAB3A的磷酸化增加会破坏SVPs的顺向轴突转运。在iNeurons中敲除相反的蛋白磷酸酶1H（PPM1H）会产生这种现象。在这些模型中，突触蛋白的分布区域发生改变；突触素和突触素-2被隔离在神经元细胞体中，沿着轴突向突触前位点的输送减少。我们发现RAB3A的磷酸化破坏了与马达适配蛋白MADD的结合，可能阻止了驱动顺向SVP转运的RAB3A-MADD-KIF1A/1Bβ复合物的形成。RAB3A的过度磷酸化还破坏了与RAB3GAP和RAB-GDI1的相互作用。我们的结果表明，致病性超活性LRRK2可能通过一种机制参与PD中与特征性非运动和认知表现相关的突触稳态改变[10]。

综上所述，Gdi1基因编码的αGDI蛋白在调节囊泡转运和神经发育中发挥重要作用。GDI1的突变与智力障碍和非综合征性智力障碍有关，并且GDI1的表达与AD患者的病情有关。此外，GDI1还与骨形成分化有关，并且可能成为骨质疏松症治疗的新靶点。GDI1在神经发育障碍、阿尔茨海默病和骨形成分化中的作用为这些疾病的治疗和预防提供了新的思路和策略。