Lnx2-KO 基因敲除小鼠

LNX2，也称为Ligand of Numb Protein X2，是一种E3泛素连接酶。它因其与Numb蛋白相互作用并促进Numb蛋白的降解而得名。LNX2在调节细胞命运决定蛋白NUMB的降解中发挥作用，进而影响NOTCH信号通路。NOTCH信号通路在许多生物学过程中至关重要，包括细胞分化、增殖、发育和疾病发生。

LNX2蛋白具有四个PDZ（PSD95、DLGA、ZO-1）结构域，这些结构域能够与许多其他蛋白质相互作用。LNX2蛋白除了与NUMB蛋白相互作用外，还能与多种其他蛋白质结合，这些相互作用提示LNX2蛋白在神经系统中具有其他作用，例如突触形成、神经传递和调节神经胶质功能[1]。

LNX2蛋白在早期胚胎发育中也发挥重要作用。研究表明，LNX2在卵母细胞和植入前胚胎中表达。LNX2敲低胚胎能够正常进展到桑椹胚阶段，但大多数胚胎不能发育成正常的囊胚。转录分析显示，LNX2敲低胚胎中与细胞谱系特异性相关的基因（包括八聚体结合转录因子4（Oct4））的表达水平升高。此外，NOTCH和Hippo信号通路相关基因的表达水平也因LNX2敲低而升高。这些结果表明LNX2对小鼠囊胚形成至关重要，可能通过内细胞团的谱系特异性发挥作用，并可能参与早期胚胎发育中各种基因的转录调节[2]。

除了在神经系统和早期胚胎发育中的作用外，LNX2还与脂肪组织来源的间充质干细胞（ADSCs）的神经分化有关。研究表明，ADSCs在神经分化后LNX2表达升高。LNX2敲低可能会阻断ADSCs的神经分化，这表现为神经样细胞数量和每个细胞树突数量减少，以及神经标记物（包括β-微管蛋白III、Nestin和MAP2）表达降低。研究还发现，LNX2沉默抑制了分化ADSCs中β-catenin的核转位。荧光素酶报告基因实验表明，LNX2通过降低其转录活性来抑制wnt/β-catenin通路。此外，结果表明，LNX2表达受到ghrelin的促进，其抑制减弱了ghrelin对神经分化的影响。这些结果表明LNX2参与ghrelin促进ADSCs神经分化的过程[3]。

LNX2蛋白在早期斑马鱼胰腺的内分泌细胞分化中也发挥重要作用。研究显示，LNX2a基因在斑马鱼胚胎的腹前胰腺芽和大脑中表达。LNX2a敲低导致来自腹侧芽的外分泌细胞类型的分化特异性抑制，而对内分泌细胞类型的影响较小。LNX2a外显子2/内含子2剪接突变体未能复制这一表型，但去除外显子2剪接供体位点的突变体却能够。研究还发现，LNX2b与其同源物LNX2a功能冗余。LNX2a外显子2/3剪接的抑制导致外显子2跳跃并产生N-截断蛋白，该蛋白作为干扰分子发挥作用。因此，外分泌细胞分化抑制的表型需要同时失活LNX2a和LNX2b。人类LNX1已知能稳定NUMB，研究发现抑制NUMB表达能够挽救LNX2a/b缺陷表型。此外，LNX2a/b抑制导致胰腺中Notch活性细胞的数量减少。研究认为，LNX2a/b通过NUMB在早期斑马鱼胰腺细胞类型的分化中精细调节Notch的调节[4]。

LNX2蛋白还在骨细胞中发挥重要作用。研究显示，LNX2是E3泛素连接酶和Notch抑制剂Numb的结合蛋白，在破骨细胞分化过程中上调。通过慢病毒介导的短发夹RNA下调骨髓巨噬细胞中LNX2表达会显著抑制破骨细胞形成。LNX2表达降低会减弱巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导的ERK和AKT激活，以及RANKL刺激的NF-κB和JNK通路的激活；因此，加速破骨细胞凋亡。此外，LNX2的缺失导致Numb积累增加，这促进Notch的降解并导致Notch下游靶基因Hes1的表达减少。研究得出结论，LNX2通过调节M-CSF/RANKL和Notch信号通路在破骨细胞形成过程中发挥关键作用[5]。

LNX2蛋白还在神经元甘氨酸转运蛋白GlyT2的调节中发挥重要作用。GlyT2是甘氨酸能神经传递的调节因子，它通过在突触前末端中重新捕获甘氨酸来促进甘氨酸在突触囊泡中的包装。GlyT2的表达或活性的改变会导致细胞质中甘氨酸水平降低，空甘氨酸能突触囊泡并损害神经传递。由于GlyT2功能丧失突变导致的甘氨酸能神经传递缺乏会导致过度兴奋，这是一种罕见的神经系统疾病，特征为全身僵硬和运动障碍，可能导致婴儿猝死。虽然GlyT2在病理学中的重要性已知，但该转运蛋白在分子水平的调节方式尚不清楚，这限制了当前的疗法。通过无偏见的筛选，研究发现E3泛素连接酶LNX1/2调节GlyT2的泛素化状态。LNX1/2的N端RING指结构域泛素化GlyT2的细胞质C端赖氨酸簇（K751、K773、K787和K791），这一过程调节GlyT2的表达水平和转运活性。脊髓初级神经元中内源LNX2的基因缺失会导致GlyT2表达增加，研究发现LNX2对PKC介导的GlyT2转运控制至关重要。这项工作确定了迄今为止第一个作用于GlyT2的E3泛素连接酶，揭示了一个控制突触前甘氨酸可用性的新颖分子机制。这为更好地理解GlyT2的分子调节提供了基础，有助于未来研究甘氨酸能神经传递功能障碍引起的疾病状态的分子基础，如过度兴奋和慢性疼痛[6]。

LNX2蛋白的内部力学与其功能密切相关。研究表明，通过将强电场脉冲应用于蛋白质晶体并结合时间分辨X射线晶体学，可以观察到蛋白质结构的构象变化。使用人类PDZ结构域（LNX2PDZ2）作为模型系统，研究发现蛋白质晶体能够耐受足够强的电场脉冲，以在亚微秒时间尺度上驱动协同运动。诱导的运动是微妙的，涉及多种物理机制，并发生在蛋白质结构的各个部分。电场诱导的运动的全局模式与由配体结合自然引起的局部和变构构象变化一致，包括PDZ结构域家族中保守的功能位点。这项工作为全面实验研究蛋白质功能的力学基础奠定了基础[7]。

LNX2蛋白具有独特的锌指结构域，在LNX2泛素化中发挥重要作用。LNX（Ligand of Numb Protein-X）蛋白，LNX1和LNX2，是RING和PDZ结构域为基础的E3-泛素连接酶，已知与Numb相互作用。研究发现，LNX2沉默会下调WNT和NOTCH，这两个信号通路在肿瘤发生中起关键作用。研究报道了LNX2的泛素化活性结构域的边界，其晶体结构以及功能研究。研究发现，LNX2的RING结构域由两个锌结合基序（Zn-RING-Zn）所包围，其中N端锌结合基序采用新颖的构象。尽管这个基序遵循典型的Cys2His2型锌指结构，但它没有二级结构，并形成一个开放环状构象，这尚未见报道。这个独特的N端Zn指基序对LNX2的活性和稳定性至关重要，这已通过突变研究得到证实。LNX2的Zn-RING-Zn结构域是二聚体，并呈现刚性的细长结构，发生自泛素化和N端多聚泛素化。泛素链包含所有七种可能的异肽键。这些结果已通过全长LNX2得到验证。此外，还证明了LNX2对细胞命运决定蛋白NUMB的泛素化。这项研究为LNX2功能机制的结构基础提供了依据，从而为研究针对LNX2的合适药物靶点提供了机会[8]。

LNX2蛋白还与接触蛋白相关蛋白4（Caspr4）相互作用，调节小鼠神经祖细胞（NPCs）的增殖和神经分化。Caspr4，也称为接触蛋白相关蛋白样蛋白（CNTNAP4），在脑的各个区域表达。最近的研究表明，CNTNAP4是自闭症谱系障碍（ASDs）的易感基因。然而，Caspr4在大脑中的分子功能尚未确定。研究显示，Caspr4在发育中的皮质神经发生区域SVZ的NPCs中表达。Caspr4敲低增强来自胚胎第14天小鼠SVZ的NPCs的增殖。Caspr4过表达会增加培养的小鼠NPCs的神经分化，而Caspr4敲低则降低神经分化。转染Caspr4的细胞内结构域（C4ICD）可以挽救Caspr4敲低NPCs中异常降低的神经分化。Numb结合蛋白LNX2与Caspr4以PDZ结构域依赖性方式相互作用，并在NPCs中发挥与Caspr4相似的作用。此外，转染LNX2可以挽救Caspr4敲低NPCs中降低的神经分化。相反，转染C4ICD无法挽救LNX2敲低NPCs中降低的神经分化。这些结果表明，Caspr4以LNX依赖性方式抑制神经分化。因此，这项研究揭示了Caspr4通过LNX2在NPCs中的新颖作用，这可能与其在ASDs发病机制中的作用有关[9]。

LNX2蛋白的遗传扩增与结直肠癌中WNT/β-catenin通路的上调有关。研究发现，染色体拷贝数改变（非整倍体）定义了大多数癌细胞的全基因组景观，但确定这些不平衡背后的致癌驱动因子仍然是一个未完成的任务。研究对结直肠腺癌进行了系统分析，该分析整合了基因组拷贝数变化和基因表达谱。这项分析揭示了44个高度过表达的基因，这些基因位于染色体13上的局部扩增子上，这些扩增子是结直肠癌中经常发生的。RNA干扰（RNAi）介导的沉默确定了8个候选基因，这些基因的功能丧失会降低结直肠癌细胞系中20%或更多的细胞活力。通过RNAi暴露后的全局表达分析，确定了基因NUPL1、LNX2、POLR1D、POMP、SLC7A1、DIS3、KLF5和GPR180的功能空间。其中一个候选基因LNX2，以前并未被认为是致癌基因，参与调节NOTCH信号。沉默LNX2降低了NOTCH水平，但也下调了转录因子TCF7L2并显著降低了WNT信号。因此，LNX2过表达和染色体13扩增导致WNT通路持续激活，提供了结直肠癌中NOTCH-WNT轴异常的证据[10]。

综上所述，LNX2是一种重要的E3泛素连接酶，在多种生物学过程中发挥重要作用，包括神经信号传导、胚胎发育、神经分化、骨细胞功能和肿瘤发生。LNX2蛋白通过调节NOTCH信号通路、WNT信号通路和泛素化途径来影响这些过程。LNX2的研究有助于深入理解其在各种生物学过程中的作用机制，为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。