Dclk1-KO 基因敲除小鼠

Dclk1，即双皮质素样激酶1，是一种微管相关蛋白激酶。它最初被描述为在神经元迁移和早期神经发生中起作用的蛋白，但在近年来的研究中，Dclk1已被认定为胃肠道和胰腺中静止干细胞的一种标志物，并且在胃肠道中作为刷状细胞的一种标志物。Dclk1表达在正常胰腺中识别出一组导管、胰岛和腺泡细胞，而在胰腺肿瘤发生早期，Dclk1表达增加，识别出五种上皮细胞群体，其中腺泡-导管化生（ADM）样细胞和刷状样细胞最为突出。这两种细胞群体在胰腺肿瘤发生中发挥着相反的作用，Dclk1+ ADM样细胞促进肿瘤生长，而Dclk1+刷状样细胞抑制肿瘤进展。Kras突变腺泡细胞分化为Dclk1+刷状样细胞需要转录因子SPIB的激活，并进一步由ILC2和CAFs通过分别提供IL13和IL33的细胞旁分泌环路支持。反过来，Dclk1+刷状样细胞释放血管紧张素原，对胰腺肿瘤发生具有保护作用。这些发现为Dclk1+细胞在正常胰腺和胰腺肿瘤发生中的生物学提供了新的见解，并揭示了一个涉及CAFs、ILC2和Dclk1+刷状样细胞的保护性轴，最终导致血管紧张素原的释放[1]。

Dclk1在癌症和癌症干细胞中具有多效性影响。它在胃肠道、胰腺和人类结肠的癌细胞中被确定为肿瘤干细胞标志物。Dclk1在多种癌症中的表达，如乳腺癌、肺癌、肝细胞癌、刷状细胞和人类胆管癌，为靶向Dclk1基因和下调其表达提供了途径。研究表明，当成功靶向Dclk1基因时，可以抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤细胞停滞。此外，Dclk1在多种癌症转移中也起着重要作用。Dclk1与多种干细胞受体、信号通路和基因的相关性表明，它在促进肿瘤发生中起着直接或间接的作用。通过使用siRNA、miRNA、CRISPR/Cas9技术、纳米分子、特异性单克隆抗体和沉默由Dclk1调节的通路等靶向策略下调DCLK1表达，在胃肠道（GI）癌症的体外和体内研究中显示出有希望的结果[2]。

Dclk1是胆管癌（CCA）中一种潜在的干细胞标志物。DCLK1在CCA细胞培养中的表达和生物功能已被评估。与未分选的细胞相比，DCLK1在LGR5+ pCCA和CD133+ iCCA细胞中基因和蛋白表达增加。选择性DCLK1抑制剂（LRRK2-IN-1）显示出剂量依赖性的抗增殖作用。LRRK2-IN-1显著抑制细胞增殖、诱导凋亡，并降低iCCA和pCCA的集落形成能力和集落大小。原位分析证实，DCLK1仅存在于肿瘤中，而不存在于健康组织中。有趣的是，DCLK1在iCCA（高）、pCCA（高）、HCC（低）和肝硬化（低）患者的血清样本中被检测到，但在健康对照中几乎检测不到。DCLK1表征了iCCACD133+和pCCALGR5+中的一种特定的CSC亚群，其抑制在原代CCA细胞培养中表现出抗肿瘤作用。人DCLK1血清可能代表CCA早期诊断的血清生物标志物[3]。

在肠道肿瘤中，Dclk1+细胞表现出与正常肠道和肿瘤细胞相关的微管和肌动蛋白细胞骨架（例如Rac2）以及Src家族激酶（即Hck、Lyn、Csk和Ptpn6）的高度表达。磷酸化的Hck和磷酸化的Lyn在Lgr5+的肠道肿瘤细胞中表达。这揭示了在Dclk1+肠道肿瘤细胞中高度表达的因子，这些因子可能有助于开发针对癌症干细胞的靶向治疗[4]。

Dclk1和Dclk1表达的细胞在癌症中的功能意义已被广泛研究。Dclk1是一种微管相关蛋白，具有C端丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。最初被描述为在微管聚合和神经元迁移的背景下标记放射胶质细胞，可能在早期神经发生中发挥作用。此外，Dclk1还被提出是静止的胃肠和胰腺干细胞的标志物，但近年来已被认为是在胃肠道中标记刷状细胞的一种标志物。尽管Dclk1+刷状细胞现在被认为是正常肠道的生态位或感觉细胞，但越来越多的证据支持Dclk1功能在多种恶性肿瘤中的作用，调节多种关键通路，包括Kras信号传导。这些研究进展有助于我们更好地理解Dclk1在肿瘤发生和癌症中的重要性[5]。

结构引导的预测表明，DCLK1是一种功能性丝氨酸/苏氨酸（S/T）激酶，是双皮质素家族蛋白的成员，该家族蛋白以其结合微管（MTs）的能力为特征。DCLK1是一种已提出的癌症驱动基因，其上调与几种实体癌类型的总生存率较差相关。然而，DCLK1如何与MTs相关以及其激酶功能如何促进促肿瘤过程尚不清楚。这一综述基于结构模型，不仅提出了特定结构域的特定功能，而且还试图预测单个体细胞错义突变对DCLK1功能的影响。DCLK1中体细胞错义突变最常位于N端MT结合区域，并可能影响DCLK1结合αβ-微管蛋白和聚合和稳定MTs的能力。此外，DCLK1的MT结合亲和力受到其自身磷酸化的负调节，因此，影响激酶活性的突变可能间接改变MT动力学。这一新兴的图景描绘了DCLK1作为一种MT相关蛋白，其与微管蛋白异源二聚体和MTs的相互作用是受严格控制的过程，当这些过程被破坏时，可能会赋予促肿瘤特性[6]。

在免疫组化（IHC）的基础上，通过基因表达分析对三阴性乳腺癌（TNBCs）进行分子分型是理解这种异质性疾病的分子本质并指导个体化治疗的关键。通过分析复旦大学上海癌症中心（FUSCC）和癌症基因组图谱数据集（TCGA）中TNBCs的RNA测序数据，确定了可以识别特定分子亚型的标志物。对来自FUSCC的210例TNBCs的肿瘤切片进行了免疫组化染色，建立了一个基于IHC的分类器，并将其应用于另外两组（n = 183和214）。选择雄激素受体（AR）、CD8、FOXC1和DCLK1作为免疫组化标志物，并根据染色结果将TNBCs分为五个亚型：（a）IHC-LAR（AR阳性[+]），（b）IHC-IM（AR阴性[-]，CD8+），（c）IHC-BLIS（AR-，CD8-，FOXC1+），（d）IHC-MES（AR-，CD8-，FOXC1-，DCLK1+），和（e）IHC-unclassifiable（AR-，CD8-，FOXC1-，DCLK1-）。κ统计量表明，IHC分类与mRNA分类之间有实质性的一致性。多变量生存分析表明，我们的IHC分类是复发无病生存的独立预后因素。转录组数据和组织病理学观察暗示了不同亚型的潜在治疗策略。IHC-LAR亚型显示出HER2通路的相对激活。IHC-IM亚型倾向于表现出免疫炎症表型，其特征是CD8+ T细胞浸润肿瘤实质。IHC-BLIS亚型表现出VEGF特征的强表达。IHC-MES亚型显示出JAK/STAT3信号通路的激活。我们开发了一种基于IHC的方法来对TNBCs进行分子分型。这种基于IHC的分类可以为预后评估提供额外信息。它允许在大规模临床试验中对TNBC患者进行分组，并在某些亚型中评估靶向治疗的有效性[7]。

通过全基因组荟萃分析和肾脏转录组数据集的整合，确定了与糖尿病肾病（DKD）相关的新的遗传因子和基因。荟萃分析确定了TENM2基因中的一个新型内含子变异（rs72831309），与较低风险的慢性肾脏病（eGFR<60 ml/min per 1.73 m2）和DKD（微量白蛋白尿或更严重）表型相关。基因水平分析确定了与DKD相关的十个基因（COL20A1、DCLK1、EIF4E、PTPRN-RESP18、GPR158、INIP-SNX30、LSM14A和MFF）。GWAS与人类肾小球和肾小管表达数据的整合表明，与DKD相关的个体在肾小管中AKIRIN2基因表达较高。GWAS中六个位点内的主要SNPs显著改变了肾脏中附近CpG位点的DNA甲基化。肾脏肾小管或肾小球中主要基因的表达与相关病理表型相关（例如，TENM2表达与eGFR呈正相关[p=1.6×10-8]，与肾小管间质纤维化呈负相关[p=2.0×10-9]，肾小管中DCLK1表达与纤维化呈正相关[p=7.4×10-16]，SNX30表达与eGFR呈正相关[p=5.8×10-14]，与纤维化呈负相关[p<2.0×10-16]）。总的来说，结果表明了与DKD发病机制相关的新的基因。GWAS荟萃分析结果可以通过1型和2型糖尿病（T1D和T2D）和常见代谢疾病（CMD）知识门户访问，并从其各自的下载页面下载[8]。

长期使用精神药物的副作用与通过重组和正常化神经元连接来逆转与疾病相关的改变有关。触发药物诱导的大脑塑性的分子因素仍然只有部分被理解。Dclk1具有在突触可塑性和神经发生过程中微管聚合活性。然而，Dclk1基因表现出复杂的转录调控模式，具有两个替代启动子和外显子剪接模式，这表明表达多种具有不同激酶活性的异构体。在这里，我们应用了下一代测序来分析几种具有不同药理作用机制的精神药物对大脑中Dclk1基因异构体表达的影响。我们使用生物信息学工具来定义小鼠伏隔核和前额叶皮层中Dclk1转录调控的范围和水平。我们还试图通过质谱分析来研究DCLK1衍生的肽的存在。我们检测到15个来自Dclk1位点的转录本（FPKM>1），包括2个药物调节的变异体（倍数变化>2）。作用于5-HT2A/C受体（5-HT2A/C）的药物以大脑区域特异性的方式调节Dclk1异构体的一组。对mianserin诱导的表达一个具有内含子保留的异构体的影响最为显著。使用qPCR验证了药物激活表达的新的替代Dclk1异构体。药物调节的异构体包含以前与人类精神分裂症和活动过度障碍相关的DCLK1基因变异。我们鉴定了一个可能来源于新型DCLK1蛋白产物的短肽。此外，由调节变体编码的蛋白结构域表明它们可能参与对经典DCLK1蛋白的负调节。总之，我们鉴定了与神经可塑性相关基因Dclk1相关的新的异构体，这些异构体在大脑中对精神药物治疗的反应中被表达[9]。

综上所述，Dclk1是一种具有多种功能的基因，参与调控多种生物学过程，包括细胞分化、发育、代谢和疾病发生。Dclk1在多种疾病中发挥重要作用，包括动脉粥样硬化、糖尿病肾病、胆管癌、胰腺肿瘤和三阴性乳腺癌。此外，Dclk1还具有独立的染色质调控功能，影响基因表达和干细胞的多能性维持。Dclk1的研究有助于深入理解基因功能和疾病发生机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。