Crkl-KO 基因敲除小鼠

CRKL基因，也称为CRK-like proto-oncogene adaptor protein，是一种编码细胞内适配蛋白的基因。这种适配蛋白包含Src同源结构域2和3（SH2/SH3）结构域，在细胞信号传导中发挥重要作用。CRKL蛋白在多种类型的癌症中过度表达，并且与不良预后相关。基因敲除和敲低CRKL在肿瘤细胞系中抑制了肿瘤细胞功能，包括细胞增殖、转化、迁移、侵袭、上皮-间质转化、对化疗药物的耐药性以及在体内肿瘤生长和转移。相反，在肿瘤细胞中过表达CRKL或Crk增强了肿瘤细胞功能。因此，CRKL和Crk已被提议作为癌症治疗的靶点。然而，目前尚不清楚CRKL和Crk在各种癌症类型中对肿瘤细胞功能是否有不同的或重叠的贡献，因为大多数研究是独立地检查Crk或CrkL[3]。

CRKL在多种癌症中的作用已经得到了广泛的研究。例如，研究发现CRKL在抗PD-1治疗抵抗的肝细胞癌（HCC）中过表达。CRKL过表达通过动员肿瘤相关中性粒细胞（TANs）来消除抗PD-1治疗的效果，TANs阻断CD8+ T细胞的浸润和功能。PD-L1+ TANs被发现是TANs的一个关键亚群，由CRKL表达调节，并表现出免疫抑制表型。机制上，CRKL通过竞争性减少Axin1结合，抑制APC介导的β-catenin的蛋白酶体降解，从而促进VEGFα和CXCL1的表达。使用人HCC样本，研究人员验证了CRKL/β-catenin/VEGFα和CXCL1的正相关关系。通过CRISPR-Cas9基因编辑（CRKL敲除）或其下游调节剂靶向CRKL，有效地恢复了抗PD-1治疗在原位小鼠模型和患者源性器官型肿瘤球体模型中的疗效。CRKL/β-catenin/VEGFα和CXCL1轴的激活是抗PD-1治疗成功的重大障碍。因此，CRKL抑制剂与抗PD-1联合可能对HCC治疗有用[1]。

CRKL基因的缺失也与22q11.2缺失综合征相关。22q11.2缺失综合征是一种常见的微缺失综合征，患者通常由于低拷贝重复块LCR22-A和LCR22-D的重排而出现缺失。TBX1基因的缺失被认为是导致表型的主要原因。一些患者有更小、重叠的缺失，这些缺失位于TBX1位点远端。这些患者中，CRKL基因被删除。这种基因的单倍不足也与22q11.2缺失综合征的发病机制有关。为了区分这些缺失（包括LCR22-B到LCR22-D区域）与更远端的22q11.2缺失（位于LCR22-D之外），研究人员提出了“中央22q11.2缺失”的术语。研究发现，与具有常见或远端22q11.2缺失的患者相比，具有中央缺失的患者中先天性心脏异常的发生率和de novo缺失的发生率明显较低。肾脏和尿路畸形、发育迟缓、认知障碍和行为问题的发生率似乎与具有常见缺失的患者相当。没有患者有腭裂。具有还包括位于LCR22-D远端的MAPK1基因的缺失的患者表现出不同的、更严重的表型，特征是先天性心脏异常、生长受限和微cephaly的发生率更高。这些结果进一步阐明了22q11.2缺失综合征谱系中的基因型-表型相关性[2]。

在黑色素瘤中，CRKL基因的扩增也与发病机制有关。研究发现，皮肤黑色素瘤和肢端黑色素瘤具有不同的基因改变。皮肤黑色素瘤中BRAF突变富集，而肢端黑色素瘤中CRKL扩增富集。在转基因斑马鱼模型中，CRKL驱动的肿瘤主要在鱼的鳍中形成。鳍是四足动物四肢的进化前体，这表明这些肢端位置的黑色素细胞可能对CRKL有独特的敏感性。RNA分析显示，与身体黑色素细胞相比，这些鳍和肢体黑色素细胞具有独特的位置基因程序，以后HOX13基因为特征。这种位置基因程序与CRKL协同作用，增强了胰岛素样生长因子（IGF）信号传导，并在肢端位点驱动肿瘤形成。这种CRKL驱动程序的消除消除了肢端黑色素瘤的解剖特异性。这些数据表明，细胞起源的解剖位置赋予了它独特的转录状态，使其仅对某些致癌性损伤敏感[4]。

CRKL基因还与化疗耐药性有关。研究发现，沉默CRKL基因可以有效地增加多柔比星诱导的细胞凋亡率，并显着逆转K562/ADR细胞的多柔比星耐药性。进一步的研究表明，敲低CRKL表达抑制了PI3K/Akt/MRP1信号传导，这表明CRKL siRNA通过调节PI3K/Akt/MRP1通路逆转了多柔比星的作用。此外，过表达MRP1可以明显降低细胞凋亡率，并逆转CRKL siRNA对K562/ADR细胞的多柔比星耐药性的抑制作用。最后，体内实验表明，CRKL沉默通过调节PI3K/Akt/MRP1信号传导在白血病中发挥了肿瘤抑制作用。这些结果表明，CRKL在白血病细胞中上调，沉默CRKL可以有效地逆转多柔比星耐药性。这些结果为化疗期间干预白血病化疗耐药性提供了一种潜在的新策略[5]。

CRKL基因在肝癌中的作用也得到了研究。研究发现，CRKL是Hippo途径传导蛋白YAP的新的相互作用伙伴。CRKL在HCC患者中高度表达，其表达与YAP活性和不良生存预后相关。体外实验表明，CRKL依赖性细胞存活和通过肌动蛋白破坏诱导的YAP结合丧失。此外，研究人员阐明了CRKL激活JNK/JUN途径，促进YAP转录。这些数据表明，CRKL不仅通过其结合促进YAP活性，而且通过JNK/JUN激活诱导YAP转录。这强调了靶向JNK/JUN途径以抑制HCC患者YAP表达的潜在用途[6]。

CRKL基因在胃癌中的表达也得到了研究。研究发现，CRKL基因编码的适配蛋白在胃癌中扩增、过表达，并可能成为治疗靶点。基因组-wide单核苷酸多态性微阵列分析显示，在分化胃癌的三个细胞系中，五个高度扩增的染色体区域（拷贝数大于6）中有22个基因（包括ERBB2）被鉴定。CRKL基因产品是一种含有Src同源结构域2和3（SH2/SH3）结构域的适配蛋白。使用荧光原位杂交（FISH）证实，MKN74胃癌细胞系中CRKL拷贝数极高，并且在这些细胞中也观察到CRKL表达水平很高。RNA干扰介导的CRKL敲低揭示了CRKL上调胃癌细胞增殖的能力。免疫组化分析显示，在分析的360例原发性胃癌中，24.4%（88/360）的CRKL蛋白过表达。使用FISH分析还检查了360例原发性胃癌中的CRKL拷贝数，发现CRKL扩增与CRKL过表达相关。最后，研究人员发现，MKN74细胞对双重Src/BCR-ABL激酶抑制剂BMS354825敏感，这可能是通过抑制CRKL磷酸化实现的，并且MKN74细胞的增殖可以通过CRKL靶向肽处理来抑制。这些结果表明，CRKL蛋白在部分胃癌中过表达，并且与胃癌中的CRKL扩增相关。此外，这些结果表明，CRKL蛋白具有调节胃癌细胞增殖的能力，并可能作为胃癌的分子治疗靶点[7]。

CRKL基因的缺失也与神经管缺陷（NTDs）有关。研究发现，22q11.2缺失与神经管缺陷的风险增加相关。在715个父母-后代三联体中进行的外显子和基因组测序发现，6名患者存在22q11.2缺失，与普通人群相比，风险增加了23倍。此外，对另一个22q11.2缺失队列的分析表明，神经管缺陷的风险增加了12至15倍。22q11.2缺失区间内表达的基因之一CRKL的缺失足以在缺乏母体叶酸的情况下复制NTDs，其中母体叶酸缺乏会加剧NTDs的渗透性和表达性。因此，常见的22q11.2缺失会导致神经管缺陷的风险增加，这种风险可以通过叶酸补充部分缓解[8]。

综上所述，CRKL基因在多种癌症中发挥重要作用，包括肝细胞癌、黑色素瘤、白血病和胃癌。CRKL的过表达与不良预后相关，并且可能成为癌症治疗的潜在靶点。此外，CRKL基因的缺失与22q11.2缺失综合征和神经管缺陷的风险增加相关。深入研究CRKL的功能和机制对于开发新的癌症治疗策略和预防遗传性疾病具有重要意义。