Dut-KO 基因敲除小鼠

DUT基因编码脱氧尿苷三磷酸酶（dUTPase），是一种参与核苷酸代谢的重要酶。dUTPase的主要功能是维持细胞内dUTP和dTTP之间的平衡，从而防止尿嘧啶在DNA复制过程中被错误地掺入。尿嘧啶的错误掺入会导致DNA损伤和细胞死亡，因此dUTPase对于维持DNA的完整性和稳定性至关重要。

在人类细胞中，dUTPase存在两种同型异构体：核定位的DUT-N和线粒体定位的DUT-M。这两种同型异构体具有不同的亚细胞定位信号。最近的研究发现，还存在两种新的dUTPase同型异构体：DUT-3和DUT-4。DUT-3没有亚细胞定位信号，而DUT-4具有与DUT-N相同的核定位信号。通过对20种不同来源的人细胞系进行定量分析，发现DUT-N同型异构体的表达水平最高，其次是DUT-M和DUT-3。DUT-M和DUT-3的表达水平之间存在强相关性，这表明这两种同型异构体可能共享相同的启动子。血清饥饿条件下，DUT-N的表达水平在A-549和MDA-MB-231细胞中下降，而在HeLa细胞中没有变化。有趣的是，血清饥饿条件下，DUT-M和DUT-3的表达水平显著升高，而DUT-4的表达水平没有变化。这些结果表明，细胞内dUTPase的供应可能也来自细胞质，而饥饿应激引起的表达变化是细胞系依赖性的[1]。

dUT基因在真核生物、原核生物和古菌中普遍存在，这表明它在生命的早期进化中就已经出现。dUT基因在不同的生物体中存在不同的拷贝数，包括单个、串联重复和串联三倍体拷贝。此外，dUTPase基因在多种DNA病毒的基因组中作为辅助基因存在，这表明dUT基因在病毒和宿主之间发生了水平转移。在真核生物中，dUT基因具有内含子，而DNA病毒dUT基因没有内含子，这表明水平转移过程中可能存在一个中介体，如Retroid Agent，通过逆转录促进宿主mRNA和DNA病毒之间的水平转移。dUT基因从真核生物、原核生物和古菌转移到DNA和RNA病毒，是首个在所有三个生命领域中发生的宿主到病原体的基因转移的案例[2]。

dUT基因的抑制会导致DNA损伤。例如，在涡虫Dugesia ryukyuensis中，抑制Dr-dut基因会导致涡虫死亡和DNA损伤。Dr-dut基因沉默后，DNA损伤反应基因Dr-atm和DNA修复基因Dr-rad51和Dr-rad51c的表达水平暂时升高，然后随着喂食的进行而下降。当RNAi处理的涡虫被截肢后，头部和尾部部分都无法再生，并且分别在25天和29天后死亡。此外，给予5-氟尿嘧啶（5-FU）也会导致涡虫死亡和DNA损伤，并且在喂食Dr-dut RNAi的涡虫中，5-FU会协同导致更高的基因毒性[3]。

dUT基因的突变与糖尿病和骨髓衰竭综合征相关。在2017年，报道了一个纯合子DUT突变，导致糖尿病和骨髓衰竭的综合征。然而，没有发现其他具有这种组合的患者，并且DUT杂合子突变的表型尚不清楚。最近的研究描述了两个具有这种罕见综合征的无关家庭，每个家庭有两个孩子在10岁之前出现了血小板减少、巨幼红细胞症和/或贫血，随后发展为非自身免疫性糖尿病。所有受影响的儿童都检测到相同的纯合子错义DUT突变。DUT杂合子携带者没有骨髓衰竭，其中一人发展为2型糖尿病，其余人空腹血糖、胰岛素、HbA1c和C肽水平正常。异基因骨髓移植（BMT）可以纠正骨髓发育不良，但对糖尿病没有影响。BMT后的随访结果显示，患者的青春期和学校表现正常，但三人身高低于2.5个标准差。这些结果表明，DUT基因在骨髓和β细胞功能中发挥作用，而DUT基因的杂合子突变携带者似乎健康[4]。

dUT基因在病毒中也发挥作用。例如，在蛙病毒中，胸苷激酶（TK）和dUTPase基因位点可以同时用于外源基因的表达。在Δ67R-RGV重组蛙病毒中，整个DUT基因被增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因所取代。然后，通过同源重组将红色荧光蛋白（RFP）基因插入到TK位点。通过九轮噬斑筛选，生成了一种新的重组病毒ΔDUT, TK-RGV，该病毒可以同时发出绿色和红色荧光。此外，ΔDUT, TK-RGV的生长曲线与野生型病毒和Δ67R-RGV相似。这些结果表明，DUT和TK基因位点可以同时用于外源基因的表达[5]。

dUT基因在肝细胞癌（HCC）中也发挥重要作用。研究发现，42%的HCC肿瘤中DUT基因过表达，并与HCC的晚期阶段相关。在HCC细胞系中敲除DUT基因后，细胞增殖受到抑制，细胞周期停滞，并自发诱导DNA损伤。DUT基因的过表达和敲除实验都显示了对氧化应激的保护作用。转录组分析表明，NF-κB生存信号通路是DUT下游的效应途径，用于克服氧化应激引起的细胞死亡。有趣的是，在肝祖细胞类器官中稳定表达DUT可以赋予对酪氨酸激酶抑制剂（TKI）索拉非尼的耐药性。通过TAS-114靶向dUTPase活性可以增强对HCC生长的抑制，与索拉非尼协同作用以改善治疗敏感性。这些结果表明，DUT基因在HCC中过表达，并且靶向dUTPase活性可能为HCC的治疗提供新的机会[6]。

dUT基因的突变也与一种新的单基因综合征相关，该综合征以早期糖尿病和骨髓衰竭为特征。通过全外显子测序，在两个具有两个受影响兄弟姐妹的家庭中发现了一个单一的纯合子错义突变，该突变位于dUTPase（DUT）基因中，影响了线粒体（DUT-M p.Y142C）和核（DUT-N p.Y54C）同型异构体。在另一个无关联的家庭中，也发现了相同的纯合子突变。DUT基因对于维持DNA的完整性至关重要，它通过防止尿嘧啶掺入DNA来防止DNA毒性和细胞死亡。研究发现，DUT基因沉默会导致人鼠胰岛β细胞通过内在细胞死亡途径发生凋亡。这些发现支持了严格控制DNA代谢对β细胞完整性的重要性，并建议对接受影响dUTP平衡的药物治疗的患者进行密切的代谢监测[7]。

一些细菌和古菌物种缺乏已知的dUTPase基因，但仍然能够有效地维持DNA的完整性。这些dUTPase-基因型细菌和古菌可能通过以下策略来应对尿嘧啶的积累：同时缺乏或抑制尿嘧啶-DNA糖基化酶（UNG）和尿嘧啶-DNA代谢的外源或替代代谢酶。此外，一些先前未与dUTPase活性相关的基因可能仍然编码能够水解dUTP的酶。这些结果表明，一些单细胞微生物可能能够有效地应对缺乏已知dUTPase基因的dUTPase-基因型，并可能导致其基因组DNA中尿嘧啶的异常积累[8]。

在Escherichia coli中，dUT基因的分离和鉴定为研究dUTPase的结构和功能提供了基础。通过限制性内切酶图谱分析，确定了dUT基因在E. coli基因组中的位置。此外，在“maxicell”蛋白质合成系统中，发现dUT基因编码两个蛋白质条带，其中一个与纯化的dUTPase亚基的大小一致。这些研究结果为研究dUT基因的结构和功能提供了重要的信息[9]。

dUT基因的遗传变异与人类乳头瘤病毒（HPV）感染和宫颈癌的风险增加相关。研究发现，DUT基因中的两个单核苷酸多态性（SNP）与宫颈癌的风险增加相关。rs3784619和rs11637235位点的纯合子等位基因与宫颈癌前病变和宫颈癌的风险显著增加相关。此外，在HPV阳性组中，rs3784619和rs11637235位点的纯合子等位基因也与宫颈癌的风险显著增加相关。这些结果表明，DUT基因的遗传变异可能与HPV感染和宫颈癌的发生发展相关，并且可以成为宫颈癌早期预测的生物标志物[10]。

综上所述，DUT基因在维持DNA的完整性和稳定性方面发挥重要作用，并且在多种疾病中发挥重要作用，包括糖尿病、骨髓衰竭、肝细胞癌和宫颈癌。此外，DUT基因在病毒中也发挥作用，并且一些细菌和古菌物种缺乏已知的dUTPase基因，但仍然能够有效地维持DNA的完整性。因此，DUT基因的研究对于深入理解DNA代谢的生物学功能和疾病发生机制具有重要意义。