Cherp-flox 基因敲除小鼠

钙稳态内质网蛋白（CHERP）是一种在多种细胞过程中发挥重要作用的蛋白质。CHERP首先被发现与内质网中的肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3R）共定位，并参与细胞内钙信号传导。其结构特征包括一个核定位信号和一个富含精氨酸/丝氨酸二肽重复序列的类似域，这些结构使其能够与剪接体相互作用[1]。CHERP的功能在细胞核中尚未完全明了，但研究表明，CHERP在调节选择性mRNA剪接事件中发挥关键作用。它通过与其U2小核核糖核蛋白（U2 snRNPs）和U2 snRNP相关蛋白的相互作用，影响选择性剪接事件的发生，其中内含子保留是最常见的事件[1]。CHERP的缺失导致U2OS细胞核中多聚腺苷酸RNA的积累，并导致细胞周期进展异常和细胞分裂异常[1]。

CHERP的异常调节与癌症的发生发展密切相关。在结直肠癌组织中，CHERP及其结合伴侣SR140的表达显著上调。CHERP和SR140可以形成蛋白质复合物来稳定彼此。敲低CHERP或SR140会引发双链DNA断裂和细胞死亡。CHERP和SR140通过结合调节性外显子4并调节UPF3A剪接来作为RNA监测因子UPF3A的剪接靶点。UPF3A的敲低在体外和小鼠中重现了CHERP/SR140耗竭的效果。UPF3A的过表达显著挽救了CHERP/SR140耗竭细胞的增殖缺陷。这些结果表明，CHERP/SR140在促进肿瘤发生中的作用部分是通过调节UPF3A变体的表达来介导的[2]。

CHERP、SR140和SPF45形成了一个紧密的物理和功能上协调的复合物，这个复合物通过抑制由亚最佳3'剪接位点包围的短外显子，调节多种选择性剪接事件。这些选择性剪接事件包括细胞周期进程中具有重要功能的基因中的选择性外显子，如G2/M关键调节因子FOXM1和纺锤体调节因子SPDL1。这三个因子的任何一种的敲低都会导致HeLa细胞中G2/M期阻滞和细胞凋亡增加。促进FOXM1或SPDL1剪接的变化部分重现了SPF45/SR140/CHERP敲低对细胞生长的影响，这表明该复合物协调了一个选择性剪接的程序，这对于有效的细胞增殖是必要的[3]。

RNA结合基序蛋白17（RBM17）是剪接体的一部分，对细胞存活和维持至关重要。RBM17与剪接体因子U2SURP和CHERP相互作用，它们相互调节彼此的稳定性，并在小鼠和人类细胞中相互调节。这三个蛋白质中的任何一个的单独敲低都会导致剪接和基因表达的变化，这些变化在富含RNA处理因子的转录本中重叠。这些结果表明，除了驱动组成型剪接之外，剪接体因子可以调节特定目标的选择性剪接[4]。

CHERP在细胞内钙信号传导中的作用已经被重新评估。细胞质中钙离子的变化，由于内质网中细胞内钙通道的激活，调节细胞生长和分化的多个方面。CHERP是一种广泛表达的蛋白质，被认为是两种主要类型的内质网钙通道的调节因子，肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3Rs）和Ryanodine受体（RyRs），对有丝分裂循环产生的影响。然而，CHERP调节细胞内钙通道以影响细胞生长的方式尚不清楚。这里，我们挑战了CHERP作为IP3Rs和RyRs的直接细胞质调节因子的先前发现，并建议CHERP在细胞核中起作用，通过调节U2 snRNA剪接体复合物的功能来影响细胞增殖。因此，CHERP对细胞生长的先前报道的影响很可能是剪接体功能改变引起的间接影响，这与先前数据显示U2 snRNP成分的功能丧失可以干扰细胞生长并诱导细胞周期阻滞相一致[5]。

在真核生物的转录过程中，RNA聚合酶II在其最大亚基的羧基末端结构域（CTD）上经历动态的翻译后修饰，产生一个信息丰富的PTM景观，转录调节因子可以与之结合。CTD七肽的Ser5和Ser2的磷酸化与转录阶段同时发生，招募不同的转录调节因子到Pol II。为了界定不同转录阶段的蛋白质互作组，我们在体外重建了CTD在Ser5和Ser2的磷酸化模式。我们的结果表明，Ser2和Ser5的CTD七肽的磷酸化在不同的转录阶段招募了不同的蛋白质互作组到RNA聚合酶II。特别是，我们表征了钙稳态内质网蛋白（CHERP）作为一个由磷酸化Ser2七肽结合的调节因子。RNA聚合酶II与CHERP的结合招募了一个辅助剪接复合物，其丧失会导致选择性剪接事件的广泛变化。我们的结果揭示了协调转录的PTM编码招募过程[6]。

硒蛋白K（SelK）是一种11 kDa的硒蛋白，可能参与调节氧化应激、内质网（ER）应激和免疫反应。为了探索SelK在免疫反应过程中的功能，设计了一些短发夹RNA（shRNA）用于构建重组质粒，以在体外下调SelK基因的表达。这些shRNA在mRNA和蛋白质水平上特异且有效地干扰了SelK的表达。在抗CD3刺激的SelK敲低细胞中，钙稳态内质网蛋白（CHERP）的表达和细胞内游离Ca2+浓度显著下调。在T细胞激活和增殖过程中起重要作用的白介素2受体α链（IL-2Rα）和白介素4（IL-4）的表达也降低。硒甲硫氨酸（Se-Met）在5 µM的最佳浓度下可以上调SelK的表达，并逆转SelK敲低引起的CHERP表达和细胞内游离钙的变化。这些结果表明，SelK可能通过CHERP调节Ca2+的释放，并通过TCR刺激在T细胞的增殖和分化中发挥重要作用[7]。

核ALG-2蛋白与Ca2+稳态内质网蛋白（CHERP）以Ca2+依赖的方式相互作用，并参与调节肌醇三磷酸受体1（IP3R1）前mRNA的选择性剪接。细胞内Ca2+信号通路对从受精到细胞死亡的各种细胞过程的控制非常重要。ALG-2是一种Ca2+结合蛋白，含有五个串联重复的EF手结构域，并以Ca2+依赖的方式与各种蛋白质相互作用。尽管ALG-2存在于细胞质和细胞核中，但对其在细胞核中的功能知之甚少。Ca2+稳态内质网蛋白（CHERP）最初被认为是调节人类细胞中细胞内Ca2+动员的内质网蛋白，但最近的蛋白质组学数据表明CHERP与剪接体相关。这里，我们报告了CHERP，它包含一个富含脯氨酸的区域和一个磷酸化的Ser/Arg富集的RS样结构域，是细胞核中一种新的Ca2+依赖的ALG-2相互作用靶点。免疫荧光显微镜分析揭示了CHERP在核质中的定位，在核斑点中明显积累，这些核斑点是前mRNA剪接因子的储存和修饰位点。活细胞时间 lapse成像显示，在Ca2+动员后，核ALG-2被招募到CHERP定位的斑点中。共免疫沉淀实验结果显示CHERP与RNA聚合酶II的磷酸化形式结合。在HT1080细胞中敲低CHERP或ALG-2导致产生IP3R1前mRNA的替代剪接异构体，这些异构体除了主要异构体缺少外显子40-42外，还包括外显子41和42。此外，通过使用针对CHERP的多克隆抗体进行的RNA免疫沉淀实验检测到CHERP与IP3R1 RNA的结合。这些结果表明，CHERP和ALG-2参与调节IP3R1前mRNA的选择性剪接，并为Ca2+信号通路中剪接变体的转录后调节提供了新的见解[8]。

最近发现，CHERP的丧失导致Jurkat T淋巴细胞中Ca2+动员、活化T细胞核因子（NFAT）的激活和细胞增殖受损。单克隆抗体对CHERP的C端结构域抑制了多种细胞类型中从内质网膜囊泡释放的Ins(1,4,5)P(3)诱导的Ca2+释放，而在人类红白血病（HEL）细胞中，反义介导的CHERP敲低极大地损害了凝血酶引起的Ca2+动员。在本文中，我们进一步探索了CHERP在Jurkat T淋巴细胞中的功能。共聚焦激光免疫荧光显微镜显示，CHERP与Ins(1,4,5)P(3)受体在细胞质和核周区域共定位，正如之前在HEL细胞中所发现的那样。将含有CHERP反义cDNA的lac I调节哺乳动物表达载体转染到Jurkat细胞中，导致CHERP敲低，并损害了植物血凝素（PHA）和凝血酶引起的细胞质Ca2+的升高（通过fura-2 acetoxymethyl酯荧光测量）。CHERP下降50%降低了PHA诱导的细胞质游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的升高，但Ca2+内流不受影响。CHERP更严重的耗竭（>70%）没有影响Ins(1,4,5)P(3)受体的浓度，但将PHA引起的[Ca2+]i的升高降低到控制细胞中的≤30%，降低了Ca2+内流，并减慢了thapsigargin（一种肌浆/内质网Ca2+-ATP酶的抑制剂）引起的[Ca2+]i升高的初始速率，这表明ER Ca2+储存也存在一些缺陷。在CHERP耗竭的细胞中，Ca2+依赖的转录因子NFAT（活化T细胞的核因子）从细胞质到核的激活和转位受到抑制。此外，细胞增殖显著减慢（与HEL细胞一样），并且细胞周期G1期的主要调节因子cyclin D1减少了60%。这些发现进一步证明了CHERP是细胞中ER Ca2+动员系统的一个重要组成部分，其丧失会损害Ca2+依赖的生化途径和细胞周期的进展[9]。

CHERP是一种重要的内质网膜蛋白，其表达受反义cDNA的调节表达所抑制，从而抑制细胞内Ca2+动员，并减少细胞增殖。使用一种能够阻断InsP(3)从分离的内质网中释放Ca2+的单克隆抗体从人类红白血病（HEL）细胞cDNA表达文库中分离出一种新的4.0 kb cDNA。在所有检查的人类细胞系和组织中，都存在一个大约4.2 kb的相应mRNA转录本，但心脏和骨骼肌具有一个额外的6.4 kb的转录本。在GenBank(R)中鉴定出许多组织和生物体中的同源表达序列标签，表明该基因在高等真核生物中普遍表达。该基因定位于人类染色体19p13.1。cDNA预测了一个100 kDa的蛋白质，命名为Ca2+稳态内质网蛋白（CHERP），具有两个假定的跨膜结构域、多个保守的磷酸化位点、一个12个重复的聚谷氨酰胺结构域和几个不完美的色氨酸和组氨酸八肽和九肽重复区域。全长cDNA的体外翻译产生了M(r) 128000和100000的蛋白质，这与许多细胞类型中通过Western blotting检测到的蛋白质条带相对应。CHERP在HEL细胞中与InsP(3)受体共定位。将反义cDNA转染到HEL细胞中导致5天内CHERP下降80%，显著降低了凝血酶引起的细胞内Ca2+动员，DNA合成减少，生长停滞，表明该蛋白在Ca2+稳态、生长和增殖中发挥着重要作用[10]。

综上所述，CHERP是一种在多种细胞过程中发挥重要作用的蛋白质。它在细胞核中调节选择性mRNA剪接事件，并通过与U2 snRNPs和U2 snRNP相关蛋白的相互作用影响选择性剪接事件的发生。CHERP的异常调节与癌症的发生发展密切相关，它在结直肠癌中表达上调，并通过调节UPF3A变体的表达来促进肿瘤发生。CHERP还与SR140和SPF45形成复合物，调节细胞周期相关基因的选择性剪接，从而控制细胞增殖。此外，CHERP还参与细胞内钙信号传导，并通过与IP3R共定位来调节细胞内Ca2+的动员。CHERP的研究对于深入理解其在细胞过程中的功能和疾病发生机制具有重要意义。