Isg20-flox 基因敲除小鼠

ISG20，也称为干扰素刺激基因20，是一种在酵母RNA外切酶4同源物（REX4）亚家族和DEDDh外切酶家族中发现的RNA外切酶。该基因编码一种20-kDa的蛋白质，负责切割单链RNA和DNA。ISG20也被称为HEM45（HeLa雌激素调节，带45）。ISG20的表达可以由I型和II型干扰素（IFNs）在各种细胞系中诱导或调节。ISG20在介导干扰素的抗病毒活性方面发挥着作用。此外，ISG20可能是某些炎症条件下潜在的易感性生物标志物或药理学靶点[1]。ISG20属于大型DEDD外切酶家族，在原核生物和真核生物中都有存在。ISG20最初在体外表现出强烈的RNA酶活性，这表明其抑制作用是通过直接降解病毒RNA来介导的。自那时以来，ISG20的这种作用机制已进一步阐明，并强调了ISG20的额外抗病毒活性，包括直接降解脱氨基病毒DNA和病毒RNA和非自我RNA的翻译抑制。该综述重点介绍了ISG20抑制病毒的主要分子机制，并讨论了控制其作用特异性或耐药性的最新进展[2]。

ISG20是一种3'-5'外切酶酶，之前已被证明可以结合并降解乙型肝炎病毒（HBV）转录物。本研究表明，N6-甲基腺苷（m6A）修饰的HBV转录物被ISG20选择性地识别和处理以进行降解。此外，ISG20的这种作用受m6A读取蛋白YTHDF2（YTH结构域家族2）的严格调节。之前，我们确定了一个独特的m6A位点位于HBV转录物中，并证实了核苷酸A1907的甲基化调节HBV生命周期。在本报告中，我们现在表明，A1907处的甲基化是IFN-α介导的HBV RNA降解的关键调节因子。我们发现，当HBV表达细胞中的甲基转移酶或m6A读取蛋白YTHDF2被沉默时，HBV RNA对ISG20介导的降解的敏感性降低。通过使用酶学失活的ISG20D94G形式，我们进一步证明ISG20与m6A修饰的HBV RNA和YTHDF2蛋白形成复合物。由于末端冗余，HBV基因组核苷酸A1907位置在转录过程中被前基因组RNA（pgRNA）获得两次，因此甲基化位点编码在5'和3'ε茎环中。我们产生了HBV突变体，这些突变体在任一末端（5'或3'）或两个末端（5'& 3'）缺乏m6A位点。使用这些突变体，我们证明了m6A修饰的HBV RNA受ISG20介导的降解，并提出了一系列事件，其中ISG20与YTHDF2结合并识别m6A修饰的HBV转录物以执行核糖核酸酶活性。这是第一个确定RNA的m6A修饰在IFN-α诱导的病毒RNA降解中的先前未知作用的研究，并提出了YTHDF2蛋白作为IFN-α介导的病毒RNA降解所需辅助因子的新作用[3]。

除了调节抗病毒反应外，驻留肾细胞中Toll样受体3（TLR3）表达的增加在一些类型的肾小球肾炎的发展中发挥作用。TLR3的激活导致I型干扰素（IFN）的产生，这诱导干扰素刺激基因（ISGs）的表达。然而，ISG20在驻留肾细胞中的表达作用尚不清楚。本研究中，用聚肌苷酸-聚胞嘧啶酸（poly IC）、大肠杆菌脂多糖（LPS）、R848和CpG（分别为TLR3、TLR4、TLR7和TLR9激动剂）处理了培养的正常人肾小球内皮细胞（GECs）。通过定量逆转录聚合酶链反应测量了ISG20、CX3CL1/fractalkine和CXCL10/IP-10的mRNA水平。通过Western印迹评估了ISG20蛋白表达。使用RNA干扰敲低IFN-β和ISG20表达。通过酶联免疫吸附测定评估了CX3CL1蛋白水平。我们进行了免疫荧光以检查狼疮性肾炎（LN）患者活检标本中内皮ISG20的表达。在GECs中，ISG20 mRNA和蛋白的表达由polyIC增加，而不是由LPS、R848或CpG处理。此外，ISG20敲低可防止poly IC诱导的CX3CL1表达，但对CXCL10表达没有影响。在增殖性LN患者的活检标本中观察到强烈的内皮ISG20免疫反应。在GECs中，ISG20通过TLR3而不是TLR4、TLR7或TLR9信号传导进行调节。此外，ISG20参与调节CX3CL1的产生。除了调节抗病毒先天免疫外，ISG20还可能作为CX3CL1产生的介质，从而在LN患者中诱导肾小球炎症[4]。

氧化应激在急性肾损伤（AKI）的病理生理学中起着核心作用。虽然RNA是细胞中最易受氧化损伤的成分之一，但目前尚不清楚RNA氧化是否参与AKI的发病机制。在这项研究中，我们发现急性肾小管坏死（ATN）患者肾脏和AKI小鼠的肾小管上皮细胞（TECs）中RNA氧化水平显著升高，氧化RNA过载导致TEC损伤。我们进一步确定干扰素刺激基因20（ISG20）是AKI中RNA氧化的一种新型调节因子。ISG20在小鼠肾小管特异性缺乏显著加剧了肾损伤和缺血/再灌注诱导的AKI模型中的RNA氧化，而ISG20以依赖于外切酶活性的方式限制了RNA氧化。重要的是，ISG20的过表达保护了小鼠免受氧化RNA过表达和肾缺血/再灌注损伤，并改善了随后的蛋白聚集体积累、内质网应激和未折叠蛋白反应。因此，我们的发现直接证明了RNA氧化参与了AKI的发病机制，而ISG20在降解氧化RNA方面发挥着重要作用，这表明靶向ISG20处理的RNA氧化可能是AKI的一种创新性治疗策略[5]。

布尼亚病毒对人类健康、繁荣和粮食安全构成重大威胁。在病毒感染的反应中，干扰素（IFNs）上调数百个干扰素刺激基因（ISGs）的表达，这些基因的协同作用可以有效地抑制布尼亚病毒的复制。我们使用了一种基于流式细胞术的方法，筛选了约500个来自人类和恒河猴的独特ISGs抑制布尼亚韦拉正布尼亚病毒（BUNV，布尼亚韦拉病毒科和布尼亚病毒目的原型）复制的能力。具有抗布尼亚病毒活性的候选者进一步使用一组不同的布尼亚病毒进行检查。有趣的是，一个候选者，ISG20，对检查的大多数来自布尼亚韦拉病毒科、汉坦病毒科和纳伊罗病毒科的病毒表现出强大的抗布尼亚病毒活性，而布尼亚病毒（布尼亚病毒科）在很大程度上逃避了抑制作用。与ISG20针对其他已知被其靶向的病毒的情况类似，ISG20的抗布尼亚病毒活性依赖于其功能性RNA酶活性。通过使用基于BUNV最小基因组的感染病毒样颗粒（VLP）测定，我们证实了ISG20抑制了所有3个病毒片段的基因表达。使用体外进化，我们产生了一个具有实质性ISG20抗性的BUNV，并绘制了ISG20敏感性和抗性决定因素。综合所有数据，我们报告说，ISG20是一种广泛而有效的抗布尼亚病毒因子，但一些布尼亚病毒对ISG20具有显著的抗性。因此，ISG20敏感性和抗性可能影响布尼亚病毒的发病机制，许多布尼亚病毒是具有临床或兽医意义的突发病毒[6]。

ISG20是一种干扰素诱导的外切酶，可抑制病毒复制。虽然ISG20被认为可以降解病毒RNA，但其抗病毒机制和特异性尚不清楚。在本研究中，研究了绵羊ISG20（oISG20）在蓝舌病毒（BTV）感染中的抗病毒作用。发现BTV感染以时间和BTV感染复数（MOI）依赖性方式上调了绵羊ISG20（oISG20）的转录。过表达oISG20抑制了BTV基因组、蛋白和病毒滴度的产生，而oISG20的敲低则增加了病毒复制。发现oISG20与BTV蛋白VP4、VP5、VP6和NS2共定位，但只与VP4直接相互作用。外切酶缺陷的oISG20显著降低了BTV复制抑制效果。此外，突变oISG20与VP4的相互作用减弱，表明与VP4的结合与BTV复制的抑制有关。目前的数据表征了oISG20的抗BTV效果，并为进一步探索ISG20抑制双链RNA病毒抑制机制提供了新的线索[7]。

ISG20是一种广谱抗病毒蛋白，被认为可以直接降解病毒RNA。然而，这种抑制机制的争议性很大。在这里，我们使用VSV作为RNA病毒的模型，表明ISG20通过在没有RNA降解的情况下减少蛋白质合成来干扰病毒复制。重要的是，我们证明ISG20对大量非自我RNA底物施加翻译控制，包括那些来自转染DNA的底物，同时保留内源性转录物。这种活性与蛋白质在细胞质加工体中的定位能力相关。最后，这些功能在ISG20小鼠同源物中得到保留，其基因敲除导致小鼠对病毒感染易感性增加。总的来说，我们的结果将ISG20定位为一个重要的防御因子，能够通过翻译调节来区分RNA的自我/非自我来源[8]。

宿主干扰素刺激基因20（ISG20）通过降解病毒RNA或增强IFN信号传导对病毒表现出抗病毒作用。在这里，我们检查了ISG20在伪狂犬病毒（PRV）增殖中的作用。我们发现ISG20通过增强IFN信号传导来调节PRV复制。此外，ISG20的表达在PRV感染和poly（I：C）处理后上调。在PK15细胞中，ISG20的过表达抑制了PRV增殖，而ISG20的敲低则促进了PRV增殖。此外，ISG20的表达上调了PRV感染期间的IFN-β表达并增强了IFN下游信号传导。值得注意的是，PRV UL24抑制了ISG20的转录，从而拮抗了其抗病毒作用。进一步的域图分析表明，UL24的N末端（氨基酸1-90）负责抑制ISG20的转录。总的来说，这些发现表征了ISG20在抑制PRV复制中的作用，并增加了对宿主-PRV相互作用的理解[9]。

综上所述，ISG20是一种重要的抗病毒因子，参与调节RNA的稳定性和功能，影响基因表达和生物学过程。ISG20在多种疾病中发挥重要作用，包括肾小球肾炎、急性肾损伤和布尼亚病毒感染。此外，ISG20还具有独立的染色质调控功能，影响基因表达和干细胞的多能性维持。ISG20的研究有助于深入理解RNA表观遗传修饰的生物学功能和疾病发生机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。