Lat2-flox 基因敲除小鼠

Lat2，也称为NTAL/LAB，是链接T细胞激活的链接蛋白2（linker for activation of T cells 2）的正式名称。Lat2是一种25-30kDa的跨膜适配蛋白（TRAP），与糖脂富集的膜区（GEMs；脂筏）相关联，在特定类型的造血谱系细胞中表达[1]。Lat2在肥大细胞、单核细胞和B细胞中被FcvarepsilonRI聚集、Kit二聚化、FcgammaRI聚集和BCR聚集所诱导的酪氨酸磷酸化。Lat2还表达在静止的NK细胞中，但与相关的TRAP、LAT不同，不在静止的T细胞中表达[1]。在单核细胞和B细胞中，磷酸化的Lat2招募信号分子，如Grb2、Gab1和c-Cbl，进入受体-信号复合物[1]。

Lat2在正常造血过程中发挥重要作用。Lat2在CD34+细胞中的表达水平较低，但在细胞因子诱导的髓样和红细胞分化过程中上调。强制表达Lat2会导致红细胞和髓样分化的延迟，使CD34+细胞保持在更不成熟的状态，而Lat2敲低则加速分化[2]。Lat2作为AML1/ETO靶基因，在AML发病机制中发挥重要作用。AML1/ETO是一种白血病特异性融合致癌蛋白，由染色体易位（8；21）形成。AML1/ETO与ETO融合，导致AML1/ETO表达下调，而AML1/ETO表达下调的细胞中LAT2蛋白水平升高[5]。在AML1/ETO表达细胞中，LAT2基因表达下调，表明AML1/ETO可能通过直接机制抑制LAT2基因表达。AML1/ETO表达与组蛋白H3、H3K9和H4乙酰化水平的降低以及H3K9和H3K27三甲基化水平的升高相关。I类组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂entinostat（MS-275）和mocetinostat（MGCD0103）在AML1/ETO表达细胞中特异性地诱导LAT2表达，导致LAT2基因上几个激活组蛋白标记的增加，包括组蛋白H3K4的三甲基化。因此，Lat2在AML发病机制中发挥重要作用，其表达受到AML1/ETO的表观遗传沉默调节[6]。

Lat2在胰腺癌中也发挥重要作用。Lat2过表达在吉西他滨耐药的胰腺癌细胞中，其通过调节两个谷氨酰胺依赖的正反馈回路（LAT2/p-mTORSer2448回路和谷氨酰胺/p-mTORSer2448/谷氨酰胺合成酶回路）来促进糖酵解和降低吉西他滨（GEM）敏感性，从而发挥致癌蛋白的作用。Lat2可以促进增殖、抑制凋亡、激活糖酵解并改变谷氨酰胺代谢，以激活mTOR。吉西他滨与mTOR抑制剂（RAD001）联合使用可以逆转Lat2过表达导致的胰腺癌细胞化疗敏感性的降低。Lat2-mTOR-LDHB通路可能是胰腺癌的潜在治疗靶点[3]。

Lat2在肾脏中也发挥重要作用。Lat2在自发性高血压大鼠（SHR）的肾脏中过表达，伴随对L-DOPA的摄取能力增强，可能构成了SHR肾脏多巴胺产生增强的基础，试图克服多巴胺介导的钠尿症缺陷。Lat2在猪肾LLC-PK1上皮细胞中表达，这些细胞保留了近端小管上皮细胞的几个特性，并通过Na+非依赖性转运蛋白大量摄取L-DOPA。使用21核苷酸小干扰RNA二聚体（siRNA）特异性地抑制LLC-PK1细胞中Lat2的表达。在克隆LLC-PK1 Lat2基因后，通过扫描Lat2基因的长度以寻找AA二核苷酸序列和下游19个核苷酸，选择了Lat2 mRNA（nt 97-117）的一个靶区域。实时定量RT-PCR确定的Lat2 cDNA水平明显降低（P<0.05）。Lat2 siRNA降低了85%的[14C]-L-DOPA积累，这是一种时间和浓度依赖性的效应。L-DOPA和L-亮氨酸显著增加了细胞内[14C]-L-DOPA的流出（P<0.05）。Lat2 siRNA使[14C]-L-DOPA的外向转运减少了90%，而错配的Lat2 siRNA则没有。然而，用siRNA Lat2处理并没有影响L-DOPA诱导的[14C]-L-DOPA的分数外流。Na+非依赖性和pH敏感的L-DOPA转运蛋白可能包括异源氨基酸交换蛋白Lat2，其激活导致L-DOPA外向转运的跨刺激[4]。

Lat2在眼科学中也具有重要意义。白内障是导致全球约50%的失明的原因，与眼内晶状体透明度丧失有关，并已被证明与晶状体细胞屏障上水和溶质转运功能障碍有关。研究发现，中性氨基酸反向转运蛋白Lat2（Slc7a8）和单向转运蛋白TAT1（Slc16a10）在鼠睫状上皮和晶状体上皮中表达。相应地，Lat2的缺失导致晶状体必需氨基酸水平显著降低，这种降低受到TAT1缺陷的调节。有趣的是，Lat2的缺失导致小鼠白内障的发生率增加，尤其是老年雌性，并且当同时缺乏TAT1时，观察到协同效应。在先天性或年龄相关性白内障患者中筛选SLC7A8发现一个纯合子单核苷酸缺失在先天性白内障家族中分离。在HeLa细胞中表达时，这种LAT2突变不支持氨基酸摄取。在白内障患者中也发现了杂合子LAT2变异，其中一些在HeLa细胞中表达时显示出运输功能降低。需要进一步研究杂合子LAT2变异是否可能参与白内障的病理学。总的来说，这些结果表明氨基酸转运蛋白LAT2的缺陷与白内障形成有关，这种情况可能因TAT1缺陷而恶化[7]。

Lat2在维持脑脊液（CSF）氨基酸稳态中也发挥重要作用。脑脊液主要由位于脑室中的脉络丛（CP）产生。虽然来自血浆，但它几乎不含蛋白质（~250倍少）并且含有约2-20倍的游离氨基酸，谷氨酰胺（Gln）除外，其含量几乎相等。本研究旨在确定小鼠CP上皮中表达哪些氨基酸转运蛋白，以了解该屏障如何维持观察到的氨基酸浓度梯度。通过qRT-PCR对分离的脉络丛（CP）进行氨基酸转运蛋白表达评估，随后使用特异性抗体进行定位研究。在第一轮实验中，通过qPCR在mRNA水平上测试了32个Slc氨基酸转运蛋白中的14个，并进行了进一步研究。在这些转运蛋白中，5个被认为是高度表达的，包括SNAT1（Slc38a1）、SNAT3（Slc38a3）、LAT2（Slc7a8）、ASC1（Slc7a10）和SIT1（Slc6a20b）。其中3个通过免疫荧光可视化：SNAT1（Slc38a1），一种中性氨基酸-Na+同向转运蛋白，位于CP上皮的血液侧基底外侧膜上，而SNAT3（Slc38a3），一种氨基酸-Na+同向转运蛋白和H+反向转运蛋白，以及LAT2（Slc7a8），一种中性氨基酸反向转运蛋白，位于CSF-facing腔侧膜上。在LAT2敲除小鼠模型中，CSF Gln保持不变，而通常比血浆低2-20倍的氨基酸，特别是LAT2摄取底物亮氨酸（Leu）、缬氨酸（Val）和色氨酸（Trp）以及一些其他氨基酸，如谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）和脯氨酸（Pro）增加。这些结果表明，Gln通过SNAT1从血液中主动转运到CP上皮细胞，然后通过SNAT3和LAT2释放到CSF中。其通过LAT2的释放可能驱动该反向转运蛋白从CSF中重新摄取必需氨基酸底物，从而参与维持血浆和CSF之间的氨基酸梯度[8]。

综上所述，Lat2是一种重要的跨膜适配蛋白，在多种生物学过程中发挥重要作用，包括免疫细胞激活、造血细胞分化、癌症发生、肾脏功能和白内障形成。Lat2的表达和功能受到多种因素的调节，包括AML1/ETO和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）。Lat2的研究有助于深入理解其在正常生理和疾病发生中的作用机制，为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。