Plac1-flox 基因敲除小鼠

PLAC1（Placenta-specific 1）是一种X染色体连锁基因，其表达主要局限于胚胎发育过程中源自滋养层细胞的细胞。PLAC1定位于X染色体上的一个区域，该区域被认为对胎盘发育至关重要，尽管其在这一过程中的作用尚未明确。PLAC1在人类妊娠期间由分化滋养层细胞表达，并定位于合胞滋养层中的膜性结构，包括微绒毛质膜表面。最近的研究表明，PLAC1也由各种人类癌症细胞表达。PLAC1启动子区域的研究表明，其正常胎盘和癌细胞中的表达是由特定的转录因子相互作用驱动的。尽管对PLAC1在正常滋养层中的作用尚缺乏深入了解，但初步研究表明，癌症来源的PLAC1具有促进肿瘤生长和功能的潜力。此外，它似乎还能诱导特定的免疫反应，这可能会影响一些癌症患者的存活率，表明它可能为某些癌症的治疗提供一个治疗靶点。PLAC1还可能作为一个生物标志物，预测特定的妊娠并发症，如先兆子痫[1]。

PLAC1在人类胎盘中的表达贯穿整个妊娠期，并在滋养层细胞中特异性表达。PLAC1 mRNA在足月人类胎盘中被检测到，迁移为单一的1.7 kb转录本，但在其他胎儿或成人组织中没有检测到。PLAC1表达在整个妊娠过程中都可以观察到，而小鼠Plac1在12.5 dpc后显著减少。使用(35)S标记的核糖探针，PLAC1表达在妊娠的各个阶段（8-41周）都是滋养层细胞特异性的；在间质或蜕膜细胞中未观察到表达。使用BeWo绒毛膜癌细胞作为滋养层细胞模型，角化细胞生长因子（KGF）通过Northern分析和定量实时PCR刺激稳态PLAC1 mRNA表达约两倍。刺激仅在暴露24小时后观察到，这表明KGF的刺激作用是继发于滋养层细胞的生长或分化。暴露于胰岛素样生长因子II（IGF-II）后，mRNA水平没有变化。PLAC1在整个妊娠过程中滋养层细胞特异性表达，并受到KGF的调节，这与PLAC1在母胎界面发挥基础作用是一致的[2]。

PLAC1在鼠胎母界面上的表达模式及其在胎母界面中的作用尚不清楚。原位杂交（ISH）用于定位PLAC1 mRNA在鼠胎母界面上的位置。使用PLAC1 shRNA过表达慢病毒建立的滋养层干细胞（TS）分化模型，研究了PLAC1在着床中的作用。实时RT-PCR用于检测基因表达的变化。PLAC1仅在胚胎外锥（EPC）以及8.5和9.5 dpc的胚胎中表达。随后，PLAC1表达在13.5 dpc的海绵滋养层层中丰富，在迷宫层中适度，之后下降。有趣的是，PLAC1也由次级滋养层巨细胞和糖原滋养层细胞表达，但在初级滋养层巨细胞中不表达。PLAC1转录在TS分化过程中增加（P < 0.01），而PLAC1的敲低显著损害了TS分化。PLAC1在胎母界面和所有滋养层亚型中丰富表达，除了初级滋养层巨细胞。PLAC1敲低延迟了TS分化的进展，表明PLAC1对于正常滋养层细胞分化成各种滋养层亚群是必需的[3]。

PLAC1是最近发现的癌症-睾丸-胎盘（CTP）抗原之一，其正常组织表达有限，而在不同组织来源的广泛癌细胞中存在异常表达。重组人PLAC1的表达已经得到优化，然而，迄今为止还没有关于小鼠PLAC1生产和纯化的研究报道。在这项研究中，在小肠系统中优化了小鼠PLAC1的表达和纯化，并研究了所产生蛋白质对小鼠诱导体液反应的影响。产生了一种融合蛋白，包含小鼠PLAC1完整细胞外结构域、免疫刺激性肽、破伤风毒素P2P30和PADRE以及KDEL3信号（主要PLAC1），以及没有免疫刺激性肽的相同片段（对照PLAC1）。为了优化生产和纯化步骤，测试了不同的参数，包括菌株、培养温度、培养时间、IPTG浓度、培养基，以及不同的缓冲液用于纯化重组蛋白质。通过Western Blotting（WB）和ELISA分析确认了重组PLAC1蛋白的身份后，这些蛋白质被皮下注射到用弗氏佐剂免疫的小鼠中，并通过ELISA检测抗PLAC1抗体反应。主要和对照PLAC1的最优表达水平在BL21（DE3）和TB培养基中，在0.25 mM IPTG存在下，在15°C诱导24小时后获得。含有2%十二烷基硫酸钠的缓冲液产生了更高的产量和纯度。我们的结果表明，抗人重组PLAC1多克隆抗体在WB和ELISA分析中与主要和对照PLAC1重组蛋白都有特异性反应。两种蛋白质都能在小鼠中诱导体液反应；然而，与对照PLAC1相比，用主要PLAC1免疫的小鼠血清中的抗PLAC1抗体滴度显著更高。在这项研究中，报告了小鼠PLAC1生产和纯化的优化方案，并表明基因构建中插入免疫刺激性肽可以有效地增强对小鼠PLAC1的体液免疫反应，这可能增强对PLAC1的细胞免疫反应，导致更有效的抗肿瘤反应[4]。

胎儿生长受限（FGR）是指由各种不利因素引起的宫内生长潜能受损和不足，是导致胎儿或新生儿死亡和发病的严重围产期并发症。FGR有许多原因，其发病机制尚未完全明了。最近，越来越多的研究人员开始关注胎盘，这是胎儿和母亲之间唯一的联系。胎盘是一个重要的器官，在胎儿发育中发挥着关键作用。PLAC1是一种位于X染色体上的滋养层特异性基因，对胎盘发育至关重要。然而，PLAC1在胎儿生长受限中的生物学作用尚不清楚。在这项研究中，我们调查了PLAC1在FGR孕妇和正常妊娠胎盘中的表达变化，并探讨了PLAC1在滋养层细胞生长中的调节作用。Western blotting用于检测FGR和正常胎盘组织中PLAC1的表达。细胞计数试剂盒8（CCK-8）、划痕愈合和Transwell试验用于检测PLAC1敲低对滋养层细胞增殖、迁移和侵袭的影响。Western blotting用于检测低氧条件下PLAC1的表达，并通过CCK-8和流式细胞术检测低氧浓度下滋养层细胞的细胞活力和凋亡。与正常妊娠对照组的胎盘相比，FGR组胎盘中的PLAC1表达显著下调（p<0.05）。通过siRNA敲低PLAC1显著抑制了滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭。在低氧处理后，PLAC1蛋白的表达显著降低（p<0.05）。PLAC1的过表达可以逆转滋养层细胞的细胞活力（p<0.05），并抑制低氧浓度下滋养层细胞的凋亡（p<0.05）。FGR中的PLAC1表达降低，并不能保护滋养层细胞免受低氧损伤，表明PLAC1可能是胎儿生长受限发生的重要调节因子[5]。

综上所述，PLAC1是一种X染色体连锁基因，其表达主要局限于胚胎发育过程中源自滋养层细胞的细胞。PLAC1在人类妊娠期间由分化滋养层细胞表达，并定位于合胞滋养层中的膜性结构，包括微绒毛质膜表面。PLAC1在人类胎盘中的表达贯穿整个妊娠期，并在滋养层细胞中特异性表达。PLAC1在鼠胎母界面上的表达模式及其在胎母界面中的作用尚不清楚。PLAC1是最近发现的癌症-睾丸-胎盘（CTP）抗原之一，其正常组织表达有限，而在不同组织来源的广泛癌细胞中存在异常表达。PLAC1在胎儿生长受限中的表达降低，并不能保护滋养层细胞免受低氧损伤，表明PLAC1可能是胎儿生长受限发生的重要调节因子。