Rp9-flox 基因敲除小鼠

Rp9基因，也被称为PAP1，是前体信使RNA（Pre-mRNA）剪接过程中的一种重要的剪接因子。Pre-mRNA剪接是细胞内一种关键的生物学过程，对于真核细胞至关重要。Rp9基因的突变会导致常染色体显性遗传性视网膜色素变性（adRP），这是一种早期发病且视力丧失严重的疾病。Rp9基因的突变引起的视网膜光感受器退化机制尚不完全清楚。为了研究Rp9基因的功能和突变导致的视网膜退化的分子机制，研究人员利用CRISPR/Cas9系统在体外小鼠光感受器细胞中产生了Rp9基因敲除（KO）和点突变敲入（KI）细胞。研究发现，突变细胞中的增殖和迁移能力显著降低。RNA测序分析显示，与视网膜色素变性相关的基因Fscn2和Bbs2在突变细胞中下调。此外，Fscn2基因的Pre-mRNA剪接也受到影响。这些发现揭示了广泛表达的Rp9与疾病特异性基因之间的功能关系，为Rp9相关视网膜色素变性的疾病机制提供了新的见解[1]。

PAP1是Pim-1原癌基因的体外磷酸化靶点。尽管PAP-1与Pim-1结合，但在体内Pim-1并不磷酸化PAP-1。PAP-1最近被认为是RP9型adRP中缺陷基因之一。然而，RP9是一种罕见疾病，只有两种错义突变被描述，因此PAP-1与RP9之间联系的报道是初步的。PAP-1的确切细胞功能在当时也是未知的。研究人员报告称，PAP-1定位于包含剪接因子SC35的核斑点中，并直接与另一种剪接因子U2AF35相互作用。此外，他们使用体外和体内剪接试验来显示PAP-1具有改变Pre-mRNA剪接模式的功能，并且这种功能取决于PAP-1的磷酸化状态。他们使用相同的剪接试验来检测RP9患者中发现的两种PAP-1突变体的活性。结果显示，与野生型PAP-1相比，一种突变体H137L对剪接活性没有影响，而另一种突变体D170G导致剪接活性缺陷和PAP-1磷酸化比例降低。因此，D170G突变可能通过降低PAP-1磷酸化来改变视网膜基因的剪接，导致RP。这些结果表明，PAP-1参与Pre-mRNA剪接，并且由于还有其他三种剪接因子与adRP相关，这一发现进一步证明了PAP-1确实是RP9基因[2]。

伪基因是基因复制（非加工伪基因）和逆转座（加工伪基因）事件的残留物。研究表明，从预测的伪基因中识别基因转换候选物的方法。伪基因可能随时间积累和携带序列变异，当通过基因转换转移到基因时，这些序列变异可能成为致病的突变。研究总共识别了14,476个伪基因，包括3,426个非加工伪基因。此外，还评估了1,945个靠近其祖先基因的非加工伪基因，以确定它们在基因转换和疾病中的作用。所有11个已知的人类基因转换（具有有害影响）案例均通过这些方法成功识别。在这些伪基因中，发现了一个视网膜色素变性9（RP9）伪基因，它携带一个c.509A>G突变，导致p.Asp170Gly替换，与RP9型adRP相关。RP9中的c.509A>G突变是祖先基因与其伪基因之间基因转换的先前未被认识的例子。值得注意的是，还有两个加工伪基因也含有与疾病相关的突变。一个次黄苷酸单磷酸脱氢酶1（IMPDH1）伪基因携带一个c.676G>A突变，导致p.Asp226Asn替换，引起RP10型adRP；另一个磷酸甘油酸激酶1（PGK1）伪基因（PGK1P1）携带一个c.837T>C突变，导致p.Ile252Thr替换，与磷酸甘油酸激酶缺乏症相关。根据已发表的伪基因介导基因转换案例的序列特征，还根据非加工伪基因的序列特征对基因转换候选物进行了排名。该研究产生的所有结果和工具都可以在http://genome.uiowa.edu/pseudogenes下载[3]。

视网膜色素变性（RP）是最常见的遗传性视网膜疾病，其特征是光感受器和/或视网膜色素上皮的进行性退化，最终导致失明。Pre-mRNA加工因子（PRPF3、4、6、8、31、SNRNP200和RP9）的突变与15-20%的adRP病例相关。目前的证据表明，PRPF突变导致视网膜特异性全局剪接体失调，导致大量基因的剪接错误，这些基因涉及各种视网膜特异性功能和/或一般生物学过程，包括光转化、视黄醇代谢、光感受器盘形态发生、视网膜细胞极性、纤毛发生、细胞骨架和紧密连接组织、废物处理、炎症和细胞凋亡。重要的是，最近还记录了PRPF的其他功能，除了RNA剪接之外，这表明PRPF-RP驱动的疾病发病机制可能更加复杂。当前综述重点关注关键的RP-PRPF基因，描述了它们在RNA剪接中的作用、突变对视网膜细胞转录组和表型的影响，并在酵母、斑马鱼和小鼠等模型物种的背景下进行讨论。重要的是，还讨论了PRPF在RNA剪接之外的功能，旨在对PRPF-RP发病机制进行全面的调查。最后，详细讨论了在人类患者特异性实验室模型中进行的工作以及为RP患者开发基因和细胞替代疗法，以便读者更深入地了解疾病机制，从而促进为RP患者建立新的和更好的治疗策略[4]。

大多数人类基因包含非编码的间隔序列-内含子，必须从Pre-mRNA分子中精确切除。这一事件需要五个主要的snRNP的协调作用，以及额外的非snRNP剪接蛋白。内含子必须以核苷酸精度去除，因为即使是单个核苷酸的误差也会导致阅读框移位，产生非功能蛋白质。许多人类遗传性疾病是由影响剪接的突变引起的，包括影响直接参与剪接催化的蛋白质的突变。与核心剪接蛋白的突变相关的人类最常见遗传性疾病之一是视网膜色素变性（RP）。到目前为止，已有超过70个基因的突变与RP相关。虽然大多数突变基因在视网膜中特异性表达，但八个目标基因编码广泛表达的snRNP蛋白（Prpf3、Prpf4、Prpf6、Prpf8、Prpf31和SNRNP200/Brr2）和剪接因子（RP9和DHX38）。为什么在几乎每个细胞中都必不可少的剪接体蛋白的突变会导致一种表现出如此组织特异性表型的疾病，目前仍然是一个谜。在本次综述中，我们总结了snRNP的功能，总结了在剪接蛋白中发现的错义突变及其对蛋白质功能的影响，并讨论了可能解释为什么视网膜对这些突变敏感的具体模型[5]。

RP9型adRP位于人类7号染色体上的一个位点。研究人员报告了两个不同的与疾病相关的突变，一个在先前未鉴定的人类基因中，该基因的小鼠同源基因已通过其与Pim-1原癌基因的相互作用进行鉴定。在原始的连锁家族中，他们发现了一个错义突变H137L。在一名RP患者中发现了第二个错义突变D170G。潜在的RP9基因似乎在广泛的组织中表达，但其功能尚不清楚，并且致病机制仍有待确定[6]。

常染色体显性遗传性视网膜色素变性（adRP）位点RP9先前已被定位到7p13-p15区，位于D7S526-D7S484之间。研究人员报告了将位点细化为D7S795-D7S484区，并构建了一个大约4.8Mb的YAC连续体，跨越该区域并从其两端延伸。该连续体是通过STS内容作图构建的，并物理地排列了28个YAC克隆中的29个STS。连续体中多态性标记的顺序与使用CEPH家系中的单倍型数据组装的遗传图一致。这个连续体将为主要资源，用于构建该区域的转录图，并鉴定导致这种adRP形式的缺陷基因[7]。

一种常染色体显性遗传性视网膜色素变性（adRP）形式位于7p染色体上，最近由该实验室在一个来自英格兰东南部的单个大家族中报道。通过对家族的进一步采样和使用来自7p的多个遗传标记，构建了一系列多点连锁图谱，最有可能的疾病基因位置。从这些图谱和单倍型数据来看，该位点现在可以定位在标记D7S484和D7S526之间，估计距离为1.6-4cM。根据这个家族和其他家族的数据，估计了之前报道与该区域连锁的标记和最近全基因组多态性CA图谱中描述的标记之间的遗传距离。这些数据应有助于构建该区域的物理图，并有助于鉴定7p adRP位点的候选基因[8]。

在非综合征性视网膜色素变性（ADRP）的中国家族中，PRPF31基因的第7外显子中发现了一个新的c.544_618del75bp突变。然而，所选的家系只是整个家族的一小部分，c.544_618del75bp突变的功能尚未深入探讨。本研究旨在验证先前的研究结果并探索c.544_618del75bp突变的生物学意义。研究者扩展了ADRP家系的大小，并对PRPF31基因的所有成员和100名健康对照的DNA和cDNA进行了测序。对家族中患者的cDNA进行了实时定量PCR分析，并在体外进行了细胞培养、质粒转染和Western blot分析，以评估突变的功能效应。Sanger测序显示，突变存在于所有患者中，所有正常个体中均不存在，除了参与者III-9。生物信息学分析表明，c.544_618del75bp突变导致PRPF31蛋白中25个氨基酸的缺失。此外，mRNA表达试验显示，RP患者中PRPF31和RP9基因的mRNA表达水平显著低于对照组（p < 0.05）。最后，体外转染试验表明，突变转染组的mRNA表达水平显著低于野生型转染组（p < 0.05）。本研究表明，PRPF31基因中的c.544_618del75bp突变是本ADRP家族中的致病突变，并通过影响U4/U6-U5 tri-snRNP的形成来影响RP9基因的表达，最终导致RP的发生[9]。

T-box转录因子包含一种新型的DNA结合域，即T-box域，并由一个古老的基因家族编码。在果蝇中已鉴定出四个T-box基因，omb、Trg、org-1和H15，而在哺乳动物中，T-box基因家族已经扩大，已分离出12个人类T-box基因。研究人员已经鉴定出一个新的T-box基因TBX20，及其小鼠同源基因Tbx20，它们与果蝇H15基因的关系比任何已知的脊椎动物基因更密切。H15在腿的成虫盘中表达，与向腹侧命运的承诺相关，这表明该基因参与早期模式形成事件。研究发现，TBX20在胎儿心脏、眼睛和四肢中表达，在小鼠胚胎发生过程中，Tbx20在发育中的心脏、眼睛、腹侧神经管和四肢中表达，表明它可能在调节这些组织的发育中发挥作用。TBX20基因定位于7号染色体上的7p14-p15区域。TBX20与视网膜色素变性位点RP9和睑裂狭小综合征BPES之间的关联已被排除[10]。

综上所述，Rp9基因是一种重要的剪接因子，其突变与常染色体显性遗传性视网膜色素变性（adRP）相关。研究表明，Rp9基因的突变会影响细胞增殖、迁移和基因表达，导致视网膜光感受器退化。此外，Rp9基因的突变还会影响Pre-mRNA剪接过程，进一步影响视网膜基因的表达。Rp9基因的功能和突变机制的研究为理解RP9相关视网膜色素变性的疾病发病机制提供了新的见解，并为开发新的治疗策略提供了理论依据。