Nphs1-flox 基因敲除小鼠

Nphs1基因编码一种名为nephrin的蛋白质，它定位于肾小球足细胞的裂孔隔膜上，是肾小球滤过屏障的主要结构成分。Nphs1基因的双等位基因变异可以导致芬兰型先天性肾病综合征（CNSF），这是一种在25岁以下人群中慢性肾病第二常见的原因。目前，对于CNSF尚无有效的治疗方法。最近，研究人员评估了靶向肾小球足细胞的腺相关病毒（AAV）载体作为基因替代疗法的手段。为了进行基因替代疗法的研究，研究人员建立了一种定量和可重复的表型分析方法，用于研究已发表的、条件性的Nphs1敲除小鼠模型（Nphs1tm1.1Pgarg/J和Nphs2-Cre+）。Nphs1敲除小鼠（Nphs1fl/fl Nphs2-Cre+）表现出以下特征：1）中位生存率为18天（范围为9至43天；雄性：16.5天，雌性：20天）；2）足突密度平均为1.0 FP/µm，而对照组为2.0 FP/µm，平均滤过裂隙密度为2.64 µm/µm2，而对照组为4.36 µm/µm2；3）近端小管微囊泡数量多；4）在出生后第一周内出现蛋白尿，如尿液白蛋白与肌酐比值所示；5）血清白蛋白水平显著降低，血尿素氮和肌酐水平升高。对于这些表型特征，Nphs1敲除小鼠的雌雄之间没有观察到显著差异。研究人员定量地描述了Nphs1fl/fl Nphs2-Cre+小鼠的先天性肾病综合征的五个不同的表型特征。这些结果将为未来的基因替代疗法项目提供便利，通过允许敏感地检测甚至微妙的分子效应[1]。

在另一项研究中，研究人员调查了NPHS1基因多态性（rs437168）和ACTN4（rs3745895）在非洲裔女性中子痫前期（PE）发病机制中的关联。他们研究了637份血液样本，包括280名正常血压孕妇和357名子痫前期患者。子痫前期组被细分为早期子痫前期（n=187）和晚期子痫前期（n=170）。通过对分离的DNA进行实时PCR，对rs74315346、rs869025495、rs121908415、rs3745895和rs437168进行基因分型。结果显示，与正常对照组相比，NPHS1的rs437168的C等位基因在子痫前期中显著升高。[C vs T; p=0.0323*]和[CC vs CT/TT; p=0.0464*]。将子痫前期的亚型与对照组进行比较显示，C等位基因在早期子痫前期中显著高于对照组。[p=0.0027**]，[CC vs CT/TT; p=0.0111*]，[CC/CT vs TT p=0.0198*]和晚期子痫前期。[p=0.0259*]。其他基因分型没有显示出与子痫前期显著相关。这项研究结果表明，NPHS1的rs437168的C等位基因与早期子痫前期的发病机制显著相关，可能是非洲裔女性中早期子痫前期发生肾损伤的原因[2]。

先天性肾病综合征（CNS）是一种具有挑战性的肾病综合征形式，其特征是大量蛋白尿、低白蛋白血症和水肿。CNS的主要特征是血浆蛋白的大量泄漏。患者可以在子宫内或在出生后的前几周被诊断出来，通常在三个月之前。CNS的病因可能与遗传或非遗传因素有关。NPHS1、NPHS2、LAMB2、WT1和PLCE1基因中的致病性变异已被认为与这种疾病有关。临床过程由于显著的水肿、感染、血栓形成、甲状腺功能减退、发育不良等问题而复杂化。在他们的第一个月里，获得血管通路、频繁的静脉白蛋白输注、利尿剂的使用、感染预防和营养支持是他们管理的主要方法。这些患者的最佳治疗方法是肾脏移植。CNS的诊断和治疗仍然是临床医生面临的挑战。这篇综述提高了对CNS患者的发病机制、诊断和管理的认识[3]。

在另一项研究中，研究人员描述了一种定制的、针对性的一代测序（NGS）诊断基因面板分析，以检测37个基因中的变异，包括识别拷贝数变异（CNVs）的能力。这项研究报道了302名被转诊进行SRNS诊断基因面板分析的患者的结果。使用标准表格收集了表型和临床影响数据。通过Sanger测序/多重连接依赖性探针扩增，并在可能的情况下进行家庭分离分析，证实了通过NGS检测到的候选变异。临床表现为267名患者的肾病综合征和35名疑似Alport综合征（AS）患者。NGS面板测试确定220名儿科肾病综合征患者中有44名（20.0%）和47名成人肾病综合征患者中有10名（21.3%）以及35名血尿/AS患者中有17名（48.6%）的遗传性疾病可能性。在71名患有遗传性疾病的患者中，32名有新的致病性变异，以前没有与疾病相关，包括2名NPHS1或NPHS2基因的一个或多个外显子缺失。基因面板测试为表现为SRNS或疑似AS的患者提供了遗传诊断，应在护理途径的早期进行，并包括检测CNVs的能力，因为CNVs是基因与这种状况相关的一种新兴机制。在SRNS诊断后使用临床遗传测试有可能对患者的风险进行分层，并协助有关管理的决策[4]。

在另一项研究中，研究人员调查了中国患者中散发性局灶节段性肾小球硬化症（FSGS）患者NPHS1基因的突变。FSGS仍然是难治性肾病综合征的常见原因之一。编码足细胞特异性nephrin的NPHS1基因参与了FSGS的发病机制。研究人员调查了309名散发性FSGS患者的NPHS1基因突变，并通过二代测序进行筛选。变异体与从1000个基因组项目中提取的2504名健康对照者的变异体进行了比较。研究人员还通过三种不同的软件预测了错义变异的可能致病作用。研究人员还将这些候选的因果突变与先前研究总结的突变进行了比较。在FSGS患者中发现了NPHS1基因的32个遗传突变，包括12个同义突变、17个错义突变、1个剪接突变和2个内含子突变，其中c.G3315A（p.S1105S）是最常见的变异（261/309）。在FSGS患者中发现了两个新的错义突变c.G2638T（p.V880F）和一个新的剪接突变35830957 C>T。四种同义突变（c.C294T [p.I98I]，c.C2223T [p.T741T]，c.C2289T [p.V763V]，c.G3315A [p.S1105S]）的频率在FSGS患者中远高于对照组。四种错义突变的频率在FSGS患者中远高于对照组，其中一个（c.A3230G [p.N1077S]）在对照组中较低。五种错义突变，c.C616A（p.P206T），c.G1802C（p.G601A），c.C2309T（p.P770L），c.G2869C（p.V957L），和c.C3274T（p.R1092C），被软件分析预测为致病性突变。NPHS1基因突变在散发性FSGS患者中相当常见。研究人员强烈建议在FSGS患者的临床管理中分析NPHS1基因的突变[5]。

在另一项研究中，研究人员评估了伊朗西北部儿童原发性肾病综合征（NS）中NPHS1基因的突变。原发性肾病综合征（NS）是儿童中常见的肾小球疾病。根据其反应，使用类固醇进行治疗，并定义为类固醇敏感的NS（SSNS）和类固醇抵抗的NS（SRNS）。据报道，NPHS1基因突变出现在患有SRNS和少数SSNS的儿童中。本研究旨在评估伊朗西北部原发性NS（SSNS和SRNS）中NPHS1基因突变。在这项横断面分析研究中，研究人员评估了来自伊朗阿塞拜疆族群的20名患有原发性NS的儿童，包括10例SRNS患者（5名男性和5名女性）和10例SSNS患者（7名男性和3名女性）。从外周血中提取DNA，使用标准引物进行PCR和直接测序方法对NPHSI基因进行分析。NPHS1基因突变出现在6例SSNS患者中，包括3个杂合突变和3个纯合突变，在8例SRNS患者中，包括5个纯合突变、1个复合杂合突变和2个杂合突变。总共在NPHS1基因中检测到6个不同的突变：1个缺失、1个插入、3个错义突变和1个无义突变。仅在SRNS患者中观察到外显子4和外显子27的突变。NPHS1基因的突变可能出现在SRNS和SSNS患者中；然而，考虑到SSNS中杂合突变的发病率较高，这些病例中较轻的表型可能是对类固醇反应的原因[6]。

在另一项研究中，研究人员探索了中国患者中先天性肾病综合征（CNS）的临床表现和基因变异特征。他们纳入了一名15分钟大的男婴和一名34天大的女婴。通过下一代高通量测序检测NPHS1基因。患者1携带了NPHS1基因的两个新的杂合突变，一个是在NPHS1基因外显子2中的c.204delG，p.（Leu69fs），一个杂合移码突变；另一个是在NPHS1基因外显子28中的c.3558delT，p.（Gly1187fs），一个杂合移码突变。患者2携带了三个NPHS1的杂合突变，其中c.1561-G>A，p.Asp521Asn在外显子12中是一个杂合错义突变。它被鉴定为可能的新发致病基因。三个新的NPHS1基因杂合突变导致患者患有CNS，可以扩大NPHS1基因突变的范围[7]。

在另一项研究中，研究人员分析了日本患者中先天性肾病综合征（CNS）的NPHS1基因突变。NPHS1基因被分析用于五个不同的日本CNS患者，来自之前的一份报告（Sako M，Nakanishi K，Obana M等。日本先天性肾病综合征患者中NPHS1、NPHS2、ACTN4和WT1的分析。肾脏国际2005；67：1248-1255），该报告表明NPHS1的突变不是日本患者CNS的主要原因。从白细胞中提取基因组DNA，并使用聚合酶链反应和直接测序对NPHS1的所有外显子和外显子-内含子边界进行分析。在四名患者中发现了NPHS1的复合杂合突变，在一例患者中发现了纯合突变。有趣的是，五名患者中有三名在NPHS1中有相同的突变：nt2515(delC)。具有这种突变的杂合父母来自邻近的县。在这项研究的五名患者中有两名和之前报道的（肾脏国际2005；67：1248-1255）一名患者具有相同的突变：外显子7中的736G>T。除了这两个突变以外的所有突变，包括这两个突变，在日本以外的地区尚未有报道[8]。

在另一项研究中，研究人员为了在体内进行基因替代研究奠定了基础，建立了一种严格的、可量化的、可重复的表型评估方法，用于研究条件性Nphs1敲除小鼠模型。通过将以前用于胰腺β细胞存活研究的Nphs1fl/-小鼠与由足突蛋白启动子驱动的Cre重组酶小鼠模型（Tg（NPHS2-Cre）295Lbh/J）进行杂交，他们生成了具有足突特异性nephrin缺乏的小鼠（Nphs1fl/fl NPHS2-Cre+）。研究人员观察到nephrin缺乏小鼠的产后第5天的中位生存期，而杂合对照组和野生型（WT）对照组分别显示90%和100%的存活率（在P50天）。光学显微镜分析显示，与对照小鼠组相比，nephrin缺乏小鼠的每个肾脏切片中的肾小管微囊泡数量显著增加（P<0.0022）。透射电子显微镜显示，与对照小鼠组相比，nephrin缺乏小鼠的足突密度显著降低（P<0.0001）。此外，使用尿白蛋白与肌酐比值（UACR）进行的蛋白尿定量在nephrin缺乏小鼠中显著高于对照组。这项研究首次全面描述了nephrin缺乏小鼠模型中的肾脏表型，为未来的基因替代疗法工作奠定了基础[9]。

综上所述，Nphs1基因在肾小球滤过屏障的功能中起着关键作用，其突变与多种肾脏疾病相关，包括先天性肾病综合征、子痫前期和局灶节段性肾小球硬化症。对Nphs1基因的研究有助于深入理解这些疾病的发病机制，并为开发新的治疗方法提供理论基础。未来的研究可能会集中在基因替代疗法和靶向治疗上，以改善这些患者的预后。