Barhl1-flox 基因敲除小鼠

Barhl1基因属于哺乳动物同源异型框基因家族中的一个新亚家族。该基因在哺乳动物中的同源基因与果蝇的BarH1和BarH2基因高度相关，后者在果蝇中对于外感受器的命运决定至关重要。通过生物信息学方法，研究人员在人类和小鼠中分别鉴定了两个高度相关的同源基因，即Barhl1和Barhl2。Barhl1是小鼠中的一个新基因，而Barhl2则对应于最近在鼠中描述的mBH1 cDNA。研究人员已分离并测序了小鼠Barhl1的全长序列，并将人类BARHL1和BARHL2基因分别定位于染色体9q34和1p22。通过原位杂交技术对小鼠Barhl1表达模式进行的详细分析显示，该转录本仅在发育中的中枢神经系统（CNS）的特定区域内表达，这表明Barhl1基因可能在其果蝇同源基因BarH1和BarH2的作用中发挥类似的关键作用，即参与神经结构的细胞命运决定。特别是，Barhl1在间脑和菱脑的特定区域内显示出特异性表达，这些区域产生小脑的外部颗粒层和脊髓背侧感觉中间神经元的特定种群。因此，Barhl1的功能可能对于产生这些特定类型的神经元祖细胞至关重要。此外，基因定位和表达模式使得BARHL1成为一个有吸引力的Joubert综合征的候选基因，这是一种罕见的小脑发育异常[1]。

小鼠Barhl1同源基因是BarH亚家族成员，在发育中的小脑中起着至关重要的作用，而人类同源基因BARHL1已被提出为Joubert综合征的定位和功能候选基因。Barhl1表达已被证明是由参与BMP反应的转录因子Math1诱导的。研究人员通过使用非洲爪蟾Xvent-2（BarH亚家族成员，在BMP4途径中起作用，参与胚胎模式和神经板分化）筛选cDNA文库来分离小鼠Barhl1。他们研究了Barhl1的详细表达模式，并表明其转录在发育中的中枢神经系统（CNS）的时空和功能上受限的区域内进行。使用新的光学显微技术，他们比较了Barhl1表达区域的转录本稳态水平和细胞密度。结果表明，Barhl1在大脑背侧间脑的背侧丘脑和下丘脑中转录，转录水平相对较低。在间脑中，Barhl1最初在基底板中表达较高，随后在乳头体区域表达。在小脑中，Barhl1在菱脑唇的前部和后部显示出最高的转录水平，这些区域产生外部和内部小脑颗粒细胞以及深部核。在脊髓中，Barhl1显示出与小脑相似的转录水平，并被限制在背侧中间神经元的一个子集中。因此，这些结果表明Barhl1同源异型框基因仅在CNS的受限区域内转录，并且具有不同的转录水平，这表明存在高度调节的转录机制。此外，这些区域和细胞特异性表明Barhl1可能参与特定子集的神经元祖细胞的分化[2]。

Barhl1是一种哺乳动物同源域转录因子，属于BarH类，在发育中的内耳毛细胞、小脑颗粒细胞、前小脑神经元和丘脑神经元中表达。靶向基因灭活已经证明了Barhl1在维持这些感觉细胞和神经元的存活和/或迁移中的关键作用。研究人员报告了Barhl1在控制其在内耳和CNS中的适当时空表达模式所必需的调节序列。使用转基因方法，他们发现Barhl1在内耳和CNS中的高水平、细胞特异性表达取决于其5'启动子和3'增强子序列。5'启动子的进一步转录、结合和突变分析已经确定了两个同源蛋白结合基序，这些基序可以被Barhl1占据并激活。此外，Barhl1在内耳毛细胞以及小脑和前小脑神经元中的适当表达需要Atoh1的存在。这些数据描述了Barhl1的有用调节序列，这些序列将强烈的特异性基因表达定向到内耳毛细胞和CNS感觉神经元，建立了自调节在维持Barhl1表达中的作用，并将Atoh1确定为上游调节因子[3]。

内耳毛细胞是负责听觉的机械感受器。毛细胞特异性基因的致病缺陷是导致聋哑的主要原因之一。Barhl1是一种在发育中的毛细胞中表达的BarH类同源异型框基因，但其在家毛细胞发育中的作用尚不清楚。研究人员首先建立了一个体外分化系统，以有效地获得小鼠胚胎干细胞（mESC）衍生的毛细胞样细胞。随后，他们使用CRISPR/Cas9技术生成了一种携带靶向Barhl1破坏的mESC系，并将其用于建立的体外毛细胞分化方案。Barhl1的靶向破坏并不影响mESC向早期原始外胚层样（EPL）细胞和耳蜗祖细胞的诱导，但强烈抑制了毛细胞样细胞的分化。使用RNA测序和生物信息学，他们进一步阐明了Barhl1介导的毛细胞发育的分子机制。这些数据证明了Barhl1在家毛细胞发育中的重要作用，并为基于Barhl1突变引起的聋哑的治疗提供了基础[4]。

Barhl1是果蝇BarH类同源异型框基因的鼠类同源基因，在耳蜗中高度表达，对于长期维持介导听觉和平衡的听觉毛细胞至关重要，但关于Barhl1调节和功能在毛细胞中的分子事件知之甚少。在这项研究中，研究人员首先通过数据挖掘和体外报告检测，首次确定了Barhl1是Atoh1的直接靶基因，并且Barhl1 3'增强子中的一个E-box（E3）对于Atoh1介导的Barhl1激活至关重要。然后，他们使用CRISPR/Cas9技术生成了一个在E3位点E-box（CAGCTG）上携带突变的mESC系，并将这个E3突变mESC系进一步用于体外有效的分步毛细胞分化策略。E3位点的突变导致Barhl1表达的显著丧失，并显著减少了诱导的毛细胞样细胞的数量，而对向早期原始外胚层样细胞和耳蜗祖细胞的分化没有影响。最后，通过RNA测序分析和基因本体论（GO）富集分析，他们发现这个E3框对于维持毛细胞发育和正常功能至关重要。他们还比较了来自CDS突变和E3突变mESC的诱导细胞的转录组谱，并得到了非常一致的结果，除了Barhl1转录本本身。这些观察结果表明，Atoh1介导的Barhl1表达可能在听觉毛细胞发育中发挥重要作用。简而言之，这些发现描述了Barhl1在听觉毛细胞分化中的表达调节的详细分子机制[5]。

Barhl基因家族的进化关系和分化已在视网膜细胞系中进行研究。基础螺旋-环-螺旋（bHLH）和同源域转录因子已被证明可以确定组成脊椎动物视网膜的所有不同神经元细胞亚型。在较低脊椎动物中，这些视网膜特异性转录因子的基因旁系同源基因的出现，其功能和/或保守的非编码元件经过不同的进化，可能为在脊椎动物视网膜结构中产生神经元多样性提供了一个重要的来源。与这一假设一致，研究人员调查了同源框Barhl转录因子家族（barhl1和barhl2）在硬骨鱼和四足动物谱系中的进化。在四足动物的barhl2中，而不是barhl1，在视网膜中表达，对于无长突细胞的分化至关重要。斑马鱼有三种barhl旁系同源基因：barhl1.1、barhl1.2和barhl2，但它们的精确时空视网膜表达及其功能尚不清楚。在这里，他们对所有已知的barhl鱼类旁系同源基因进行了详细的表达模式比较，并在美鳊中描述了一种新的barhl旁系同源基因。他们对斑马鱼barhl基因在野生型和突变型视网膜中的表达进行了详细分析，发现只有barhl1.2和barhl2存在于视网膜中。他们还表明，这两个旁系同源基因在不同的神经元谱系中表达，并由视网膜特异性转录因子Atoh7以不同的方式调节。最后，他们发现美鳊中保留的两个barhl旁系同源基因（barhl1和barhl2）都在视网膜中表达，其模式与斑马鱼barhl1.2和barhl2分别相似。通过进行系统发育和共线性分析，他们提供了证据，表明barhl视网膜表达区域是一种祖先特征，可能在四足动物中由于功能冗余而丢失。硬骨鱼类和四足动物之间保留的关键视网膜特异性转录因子的旁系同源基因之间的功能差异可能为理解它们对视网膜神经元多样性的产生的影响提供重要线索。有趣的是，在硬骨鱼类中，斑马鱼barhl1.2及其美鳊同源基因barhl1的保留似乎与这两个基因在视网膜细胞系中不同的信号机制获得相关。这些发现为研究barhl基因进化与脊椎动物视网膜中细胞多样性产生的关系提供了起点[6]。

人类Barhl1同源基因BARHL1在小脑发育中起着中心作用，其表达由参与骨形态发生蛋白反应通路的转录因子Math1激活。研究人员研究了人类同源基因BARHL1，并发现人类、小鼠、猴子、大鼠和斑马鱼的同源基因高度保守，并属于包含果蝇BarH1和BarH2的BarH同源基因家族。BARHL1蛋白的N-末端有两个FIL结构域和一个富含丝氨酸/苏氨酸和脯氨酸的酸性区域，而C-末端包含一个典型的脯氨酸富集区域。二级结构分析表明，除了同源域的三个螺旋外，BARHL1蛋白具有 essentially随机的卷曲结构。他们分离了BARHL1，并定义了其在人类胚胎和胎儿中枢神经系统（CNS）中的表达模式，并将其与小鼠Barhl1转录进行了比较。BARHL1 mRNA被发现仅在CNS中表达，限制在间脑的p1-p4前脑原区，在间脑的背侧细胞中，在脊髓的dl1感觉神经元中，以及在产生小脑原基的菱脑唇中。使用新的光学显微技术对胎儿小脑细胞层的BARHL1表达进行详细分析表明，BARHL1在小脑的外部颗粒细胞和内部颗粒细胞以及小鼠成年颗粒细胞中也表达，这与Barhl1敲除小鼠表型一致，影响颗粒细胞的分化和迁移。这些发现表明，BARHL1转录的局部和细胞特异性转录控制与小鼠Barhl1转录很好地对应，并表明这个基因可能在分化BARHL1表达的神经元祖细胞中发挥作用，这些祖细胞参与人类大脑和小脑结构的模式形成[7]。

神经元在生殖菱脑唇产生，并沿着不同的途径进行长距离迁移，以在脑干中广泛分散的位置定居，产生小脑颗粒细胞和前小脑核。神经生长因子3（NT-3）信号传导已被证明对于小脑颗粒细胞的适当迁移和存活至关重要。然而，控制NT-3在小脑中表达的分子基础目前尚不清楚。在这里，研究人员报告说，在小鼠早期神经发生期间，Barhl1同源异型框基因在菱脑唇和菱脑唇衍生的迁移神经元中高度表达。其表达后来限制在小脑颗粒细胞和前小脑神经元中，这些神经元在成年小脑系统中通过苔藓纤维连接。Barhl1功能的丧失导致小脑表型，这些表型与小脑NT-3条件性敲除小鼠的表型惊人地相似，包括小脑叶片减弱、放射状迁移缺陷以及颗粒细胞凋亡增加。与这些缺陷相关的是，他们在Barhl1(-)/-小脑的后叶颗粒细胞中发现NT-3表达显著下调。此外，在Barhl1(-/-)小鼠的前小脑系统中，所有五个投射苔藓纤维的核由于神经元迁移异常和细胞凋亡增加而无法正确形成。这些结果表明Barhl1在小脑颗粒细胞和前小脑神经元的迁移和存活中发挥着重要作用，并将Barhl1与NT-3信号传导途径在小脑发育中的作用功能性地联系起来[8]。

Barhl1和Brn-3c已被确定为对内耳毛细胞的存活和维护至关重要的转录因子。关于Brn-3c或Barhl1如何在内耳中调节转录的机制知之甚少。在这项研究中，他们调查了Brn-3c和Barhl1在来自耳蜗的细胞系OC-1和OC-2中的转录功能。他们通过将Barhl1和Brn-3c的区域与异源转录因子GAL4的DNA结合域连接起来，并通过将它们共转化到OC-1和OC-2细胞系中的含有GAL4 DNA结合位点的异源启动子上来检测它们的效应，以检查这些转录因子的调节域。他们发现Brn-3c包含一个独立的N末端激活域，足以在耳蜗衍生细胞系中激活基因转录。另一方面，Barhl1被发现作为转录抑制因子，其抑制活性不限于Barhl1的特定域。此外，他们分析了Barhl1对OC-1和OC-2细胞系中神经生长因子基因NT-3和BDNF启动子的效应。然而，在这些细胞中，Barhl1并没有被发现直接调节神经生长因子启动子构建物[9]。

哺乳动物内耳的耳蜗包含三排外毛细胞和一排内毛细胞。这些毛细胞受体位于Corti器中，负责将机械刺激转化为介导听觉的电信号。迄今为止，维持这些精细感觉毛细胞的分子机制尚不清楚。研究人员报告说，靶向破坏Barhl1（果蝇BarH同源异型框基因的鼠类同源基因）导致严重到重度的听力丧失，为研究年龄相关的人类聋哑疾病提供了一个独特的模型。Barhl1在内耳发育期间在所有感觉毛细胞中表达，在毛细胞生成开始后的第2天。在Barhl1功能丧失的小鼠中，导致耳蜗中的外毛细胞和内毛细胞随着年龄的增长而进行性退化，沿着两个相反的纵向梯度。这些数据共同表明，Barhl1在小耳蜗毛细胞的长期维持中起着重要作用，但不是在这些细胞的决定或分化中的作用[10]。

综上所述，Barhl1基因在哺乳动物中枢神经系统和内耳的发育中发挥着至关重要的作用。Barhl1的表达模式在CNS中具有时空和细胞特异性，表明它在神经元祖细胞的分化和迁移中起着关键作用。Barhl1的转录调节机制涉及多个转录因子，包括Math1和Atoh1，它们在Barhl1的表达中发挥重要作用。Barhl1功能的丧失与多种神经发育异常有关，包括Joubert综合征和小脑颗粒细胞的迁移和存活缺陷。此外，Barhl1在内耳毛细胞的发育和维持中发挥着重要作用，其突变可能导致年龄相关的聋哑。Barhl1的研究有助于深入理解其在神经系统发育和听觉中的作用，并为相关疾病的治疗提供潜在靶点。