Ramp1-flox 基因敲除小鼠

Ramp1，全称为受体活性修饰蛋白1（Receptor Activity-Modifying Protein 1），是一种重要的蛋白质，它在多种生物学过程中发挥着关键作用。Ramp1与钙基因相关肽（CGRP）受体复合物中的受体样受体（Calcitonin Receptor-Like Receptor, CLR）结合，参与调节CGRP的信号传导。CGRP是一种神经肽，在疼痛传递、炎症反应、血管舒缩、神经再生和免疫调节等过程中发挥着重要作用。

Ramp1与CGRP的结合可以增强CGRP受体的活性，进而影响多种生物学过程。例如，在肠道保护方面，Nav1.8+CGRP+的痛觉神经元与肠道杯状细胞相邻，并通过CGRP-Ramp1通路信号传递，促进粘液分泌和肠道保护[1]。痛觉神经元缺失会导致粘液层变薄和菌群失调，而化学遗传学激活痛觉神经元或辣椒素治疗则可以诱导粘液层增厚。杯状细胞表达Ramp1，痛觉神经元通过CGRP-Ramp1通路信号传递，诱导杯状细胞快速排空和粘液分泌。值得注意的是，共生微生物激活痛觉神经元以控制稳态下的CGRP释放。在痛觉神经元或上皮Ramp1缺失的情况下，小鼠表现出增加的上皮应激和对结肠炎的易感性。相反，CGRP的给予可以保护痛觉神经元缺失的小鼠免受结肠炎的影响。这些发现表明，神经-杯状细胞轴协调了肠道粘液屏障的保护。

在癌症免疫监视方面，痛觉神经元对肿瘤浸润的T细胞具有免疫调节作用。肿瘤细胞与痛觉神经元的相互作用导致痛觉神经元的神经突生长增加，对有害配体的反应性和神经肽释放增加。CGRP是一种痛觉神经元产生的神经肽，它可以直接增加细胞毒性CD8+ T细胞的耗竭，从而限制其消除黑色素瘤的能力。TRPV1谱系的基因缺失、痛觉神经元的局部药理学沉默和CGRP受体Ramp1的拮抗作用均降低了肿瘤浸润的免疫细胞的耗竭，并减少了肿瘤的生长，几乎将接种了B16F10黑色素瘤细胞的小鼠的存活率翻了两倍。相反，在局部给予重组CGRP治疗的痛觉神经元缺失小鼠中，CD8+ T细胞耗竭得以恢复。与野生型CD8+ T细胞相比，Ramp1-/- CD8+ T细胞在移植到肿瘤负荷的Rag1缺陷小鼠中时，对耗竭具有保护作用。来自黑色素瘤患者的活检的单细胞RNA测序显示，肿瘤内RAMP1表达的CD8+ T细胞比其RAMP1阴性对照细胞更易耗竭，而RAMP1的过表达与较差的临床预后相关。总体而言，这些结果表明，减少肿瘤浸润痛觉神经元释放的CGRP可能是一种通过消除CGRP对细胞毒性CD8+ T细胞的免疫调节作用来改善抗肿瘤免疫的策略[2]。

在组织修复和再生方面，痛觉感觉神经元在免疫调节方面发挥着重要作用，并在不同情况下表现出保护性和有害性。研究发现，Nav1.8痛觉神经元的缺失会损害皮肤伤口愈合和肌肉再生。痛觉神经末梢生长到受伤的皮肤和肌肉组织中，并在愈合过程中通过神经肽CGRP向免疫细胞发出信号。CGRP通过受体活性修饰蛋白1（RAMP1）作用于中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞，抑制招募、加速死亡、增强胞噬作用，并将巨噬细胞极化为促修复表型。CGRP对中性粒细胞和巨噬细胞的影响是通过释放血栓形成蛋白-1（Thrombospondin-1）和随后的自分泌和/或旁分泌作用介导的。在缺乏痛觉神经元和患有周围神经病变的糖尿病小鼠中，递送一种工程化的CGRP版本可以加速伤口愈合并促进肌肉再生。利用神经免疫相互作用有可能治疗由于神经免疫相互作用失调而影响组织愈合的非愈合组织[3]。

在脾脏免疫反应方面，周围感觉神经广泛地支配各种组织，以持续监测并对外界刺激做出反应。周围感觉神经元是否支配脾脏并调节脾脏免疫反应仍然知之甚少。研究发现，感觉神经纤维广泛地支配脾脏的血管，并到达B细胞区。脾脏支配的痛觉神经元主要起源于左侧T8-T13背根神经节（DRGs），促进脾脏生发中心（GC）反应和体液免疫。痛觉神经元可以被抗原诱导的脾脏前列腺素E2（PGE2）积累激活，并随后释放CGRP，从而进一步促进脾脏GC反应的早期阶段。机制上，CGRP直接通过其受体CALCRL-RAMP1和环磷酸腺苷（cAMP）信号通路作用于B细胞。通过摄入辣椒素激活痛觉神经元可以增强脾脏GC反应和抗流感免疫。总的来说，这项研究建立了一种特定的DRG-脾脏感觉神经连接，这种连接可以促进体液免疫，为通过靶向痛觉神经系统来改善宿主防御提供了一种有希望的途径[4]。

在脑膜炎的防御方面，细菌可以通过劫持CGRP-RAMP1信号传导来促进脑部入侵。脑膜炎是由脑膜炎球菌和中B群链球菌等细菌引起的脑膜和神经系统危及生命的感染。痛觉神经元在脑膜炎的防御中发挥着重要作用。研究发现，Nav1.8+痛觉神经元在感染过程中通过神经肽CGRP向脑膜中的免疫细胞发出信号。这种神经免疫轴抑制宿主防御并加剧细菌性脑膜炎。痛觉神经元的缺失减少了肺炎链球菌和中B群链球菌这两种细菌病原体对脑膜和脑的入侵。肺炎链球菌通过其孔形成毒素溶血素激活痛觉神经元，从神经末梢释放CGRP。CGRP通过受体活性修饰蛋白1（RAMP1）作用于脑膜巨噬细胞，极化其转录反应，抑制巨噬细胞趋化因子表达、中性粒细胞招募和硬脑膜抗菌防御。巨噬细胞特异性RAMP1缺陷或RAMP1的药理学阻断增强了脑膜和脑中的免疫反应和细菌清除。因此，细菌劫持脑膜巨噬细胞中的CGRP-RAMP1信号传导来促进脑部入侵。靶向脑膜中的神经免疫轴可以增强宿主防御，并可能产生治疗细菌性脑膜炎的治疗方法[5]。

在神经源性炎症引起的疼痛方面，针对CGRP或其受体（受体样受体/受体活性修饰蛋白-1, CLR/RAMP1）的单克隆抗体在偏头痛疼痛中的作用表明，外周释放的CGRP与偏头痛疼痛有关。然而，CGRP引起外周疼痛的部位和机制仍然不清楚。通过细胞选择性RAMP1基因缺失，研究发现，从小鼠皮层三叉神经纤维释放的CGRP靶向周围Schwann细胞上的CLR/RAMP1，引发眼周机械性痛觉过敏。在人类和小鼠的Schwann细胞中，CLR/RAMP1的激活产生来自内体的长期信号，引发cAMP依赖性NO的形成。NO通过门控Schwann细胞瞬时受体电位锚蛋白1（TRPA1），释放ROS，通过正反馈方式通过痛觉神经元的TRPA1维持痛觉过敏。当封装到在酸化内体中释放有效载荷的纳米颗粒中时，CLR/RAMP1拮抗剂在抑制CGRP信号传导和痛觉过敏方面提供了更好的抑制作用。这些数据表明，CGRP介导的神经元/Schwann细胞途径介导了与神经源性炎症相关的痛觉过敏，为CGRP在小鼠中的致痛作用做出了贡献[6]。

在哮喘的神经免疫病理生理学方面，哮喘是一种慢性下呼吸道炎症性疾病，其特征是支气管高反应性。I型超敏反应是所有变应性疾病的基础，包括过敏性哮喘。然而，与炎症机制相比，神经递质（NT）和神经肽（NP）在该疾病中的作用研究较少。实际上，气道上皮含有肺神经内分泌细胞，其中充满了神经递质（血清素和GABA）和神经肽（P物质[SP]、神经激肽A [NKA]、血管活性肠肽[VIP]、钙基因相关肽[CGRP]和无孤儿[N/OFQ]），它们在暴露于变应原后被释放。同样，自主气道纤维产生乙酰胆碱（ACh）和神经肽Y（NPY）。这些NT/NP的效应各不相同；SP、NKA和血清素表现出促炎作用，而VIP、N/OFQ和GABA表现出抗炎活性。然而，CGRP和ACh具有双重效应。例如，ACh-M3轴诱导杯状细胞化生、细胞外基质沉积和支气管收缩；CGRP-RAMP1轴增强Th2和Th9反应；SP-NK1R轴促进嗜酸性粒细胞、肥大细胞和中性粒细胞中趋化因子的合成。相比之下，ACh-α7nAChR轴在ILC2中减少TNF-α、IL-1和IL-6的合成，从而减轻肺部炎症，而VIP-VPAC1、N/OFQ-NOP轴引起支气管扩张和抗炎作用。某些NT/NP，如5-HT和NKA，可以用作监测哮喘患者的生物标志物。事实上，基于吸入性皮质类固醇和抗胆碱能药物的哮喘治疗阻断M3和TRPV1受体。此外，给予实验性药物，如NK1R/NK2R拮抗剂和外源性VIP，可以减少炎症介质，表明调节NT/NP的效应是治疗哮喘的一种潜在的新方法[7]。

在皮肤适应性免疫方面，本体感觉神经系统在屏障组织中监测外部刺激，在感染和炎症下调节先天免疫细胞。然而，感觉神经元在控制适应性免疫系统中的作用，特别是对微生物组的免疫，仍然不清楚。研究发现，在皮肤中，定殖特异性T淋巴细胞和本体感觉神经元之间存在直接的神经免疫通讯，由神经肽CGRP介导。活体成像显示，定殖特异性T细胞在体内与皮肤神经纤维紧密相邻。相应地，研究发现，皮肤定殖诱导的CD8+ T淋巴细胞中CGRP受体RAMP1的表达上调。神经免疫CGRP-RAMP1信号传导轴在定殖特异性T细胞中发挥作用，限制Th17反应，并在稳态下调节微生物组反应性淋巴细胞的激活状态。因此，调节神经免疫CGRP-RAMP1信号传导在定殖特异性T细胞中调节皮肤上皮的整体激活状态，从而影响对伤口等刺激的反应结果。本体感觉神经元通过CGRP-RAMP1轴控制对微生物组的适应性免疫，突出了在稳态和病理状态下实现最佳微生物组反应性T细胞功能所需的调节和多系统协调的多个层面[8]。

在偏头痛的表观遗传调控方面，偏头痛是一种影响全球10亿人的复杂的神经血管疾病，主要影响女性。它以中重度头痛发作和伴随症状为特征。受体活性修饰蛋白（RAMP1）是CGRP受体的一个部分，是偏头痛的药物靶点。表观遗传过程，如DNA甲基化，在各种疾病的临床表现中发挥作用。DNA甲基化主要发生在基因启动子中，可以控制基因表达。研究发现，在104名女性血液DNA样本中， migraineurs的RAMP1启动子中CpG -284 bp的甲基化水平较高，这可能影响RAMP1的转录或受体的功能障碍和/或CGRP结合的改变。希望在更大的队列中证实这一发现，并建立一个表观遗传生物标志物来预测女性偏头痛的风险[9]。

在偏头痛的DNA甲基化分析方面，RAMP1是CGRP的关键受体亚基，在偏头痛中发挥着重要作用。然而，RAMP1基因的变异尚未被发现与偏头痛相关。RAMP1启动子区域的DNA甲基化是否与偏头痛相关尚不清楚。研究发现，在偏头痛组中，RAMP1启动子区域的DNA甲基化总体呈低甲基化趋势，并且两个CpG单元与阳性偏头痛家族史和女性偏头痛相关。在女性中，RAMP1启动子区域(+89, +94, +96) CpG单元的甲基化水平低于3.50%时，患偏头痛的概率显著高于甲基化水平高于阈值的女性。这项研究首次提供了RAMP1启动子区域的DNA甲基化可能与偏头痛相关的证据。在偏头痛患者中，RAMP1启动子区域的DNA甲基化总体呈低甲基化趋势，并且发现两个CpG单元与阳性偏头痛家族史和女性偏头痛相关。在女性中，RAMP1启动子区域(+89, +94, +96) CpG单元的甲基化水平较低可能是偏头痛的风险因素[10]。

综上所述，Ramp1是一种重要的蛋白质，在多种生物学过程中发挥着关键作用。Ramp1与CGRP受体复合物结合，参与调节CGRP的信号传导，影响疼痛传递、炎症反应、血管舒缩、神经再生和免疫调节等过程。Ramp1在肠道保护、癌症免疫监视、组织修复和再生、脾脏免疫反应、脑膜炎的防御、神经源性炎症引起的疼痛、哮喘的神经免疫病理生理学和皮肤适应性免疫等方面发挥着重要作用。此外，Ramp1的DNA甲基化可能与其功能相关，并可能成为偏头痛的潜在生物标志物。Ramp1的研究有助于深入理解CGRP信号传导的生物学功能和疾病发生机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。