Rhox8-flox 基因敲除小鼠

基因Rhox8是X染色体上的一个生殖同源框基因，编码转录因子，在生殖组织中特异性表达，包括睾丸、附睾、卵巢和胎盘。在鼠睾丸的生殖细胞中，许多Rhox基因都有表达，但只有Rhox8在胚胎和出生后的发育过程中特异性地表达在支持细胞中。这一发现提示Rhox8可能在胚胎生殖腺发育中发挥作用。

在之前的研究中，通过支持细胞特异性敲低RHOX8导致雄性不育，其原因是由于生殖细胞缺陷。然而，这种敲低模型在研究Rhox8的功能方面存在局限性，因为RHOX8的敲低仅在出生后发生，并且睾丸中仍然存在残余的RHOX8。在最新的一项研究中，研究者们利用CRISPR/Cas9系统生成了新的Rhox8敲除（KO）小鼠。研究显示，在突变小鼠中，性别决定和胎儿睾丸发育正常。然而，Rhox8 KO成年雄鼠的繁殖能力降低，精子发生周期被破坏，生殖细胞凋亡增加，精子数量和活力减少。有趣的是，Rhox8 KO睾丸显示出睾丸增大，伴有扩张的细精管和睾丸网，这可能是由输精管（ED）Rhox8缺失导致EDs中代谢和运输基因表达失调。这些数据表明，支持细胞中的Rhox8对于性别决定和胚胎睾丸分化不是必需的，但在完整的精子发生和最佳雄性繁殖能力方面起着重要作用[1]。

Rhox8在支持细胞中的表达模式与TOX转录因子的表达模式相似，后者在T细胞衰竭中起着关键作用。TOX是一种HMG-box转录因子，在慢性感染和癌症中的耗竭CD8+ T（Tex）细胞中表达，其功能丧失，共表达抑制受体，并且与效应（Teff）或记忆（Tmem）CD8+ T细胞相比，具有广泛的转录改变。TOX在Tex细胞形成中起着至关重要的作用，缺乏TOX时，Tex细胞无法形成。TOX被钙调神经磷酸酶和NFAT2诱导，并且在Tex细胞中形成一个正反馈循环，使其成为独立于钙调神经磷酸酶并持续存在。因此，TOX的表达导致Tex细胞通过将持续的刺激转化为独特的Tex细胞转录和表观遗传发育程序来致力于Tex细胞。这一发现表明，TOX在Tex细胞形成和维持中起着关键作用[2]。

TOX还被证明是肿瘤特异性T（TST）细胞分化的关键调节因子。在肿瘤中，TOX在功能障碍的TST细胞中高度表达，并在慢性病毒感染中的耗竭T细胞中也高度表达。TOX的表达是由慢性T细胞受体刺激和NFAT激活驱动的。在体外效应T细胞中过表达TOX诱导与T细胞衰竭相关的转录程序。相反，在肿瘤中的TST细胞中删除Tox消除了衰竭程序：Tox删除的TST细胞没有上调抑制受体基因（如Pdcd1、Entpd1、Havcr2、Cd244和Tigit）的表达，其染色质仍然大部分不可接近，并且保留了高水平的转录因子如TCF-1的表达。尽管它们具有正常、“非耗竭”的免疫表型，Tox删除的TST细胞仍然功能失调，这表明抑制受体的表达调控与效应功能的丧失是解耦的。值得注意的是，尽管Tox删除的CD8 T细胞在急性感染中对效应和记忆状态的分化是正常的，但Tox删除的TST细胞无法在肿瘤中持续存在。研究者们假设TOX诱导的衰竭程序旨在防止T细胞在慢性抗原刺激，如癌症中的过度刺激和活化诱导的细胞死亡[3]。

在慢性感染中，祖细胞样CD8+ T细胞介导长期免疫，并对免疫检查点阻断有强烈反应。这些细胞与记忆前体细胞共享转录调节因子，包括T细胞特异性转录因子1（TCF1），但它们是否采用不同的程序来适应免疫抑制环境尚不清楚。通过比较对急性病毒感染和慢性病毒感染作出反应的CD8+ T细胞的单细胞转录组和表观遗传特征，研究者们发现，祖细胞样CD8+ T细胞在T细胞反应达到峰值之前就与记忆前体细胞区分开来。研究者们发现了一个包含Tox的共表达基因模块，该模块在祖细胞样细胞中表现出更高的转录活性，并且与记忆前体细胞相比，具有更多的活性组蛋白标记。此外，胸腺细胞选择相关的高移动组蛋白盒蛋白TOX（TOX）促进了抗病毒CD8+ T细胞的持久性，并且对于祖细胞样CD8+ T细胞的程序设计是必需的。因此，对慢性病毒感染的长期CD8+ T细胞免疫需要与转录因子TOX相关的独特的转录和表观遗传程序[4]。

TOX在慢性病毒感染中耗竭T细胞表型和寿命的维持中也起着重要作用。研究者们报告称，小鼠中耗竭T细胞群体的发展和维持需要胸腺细胞选择相关的高移动组蛋白盒（TOX）蛋白。TOX由T细胞受体的高抗原刺激诱导，并且与小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染和人类丙型肝炎病毒感染中的耗竭表型相关。去除其DNA结合域会降低PD-1的mRNA和蛋白水平的表达，增强细胞因子的产生，并导致具有更多功能的T细胞表型。具有这种缺失的T细胞最初介导增强的效应功能并引起更严重的免疫病理学，但最终在数量上经历大幅下降，特别是TCF-1+自我更新的T细胞群体。总的来说，研究者们表明TOX是慢性感染过程中T细胞功能障碍的正常进展和耗竭T细胞维持的关键因素，并为CD8 T细胞固有抑制功能的抑制和免疫病理学的保护之间提供了联系[5]。

TOX还在肝细胞癌（HCC）中通过防止PD1降解来促进抗肿瘤CD8+ T细胞的耗竭。研究者们发现，在HCC中，耗竭的CD8+ T细胞中TOX表达上调。在CD8+ T细胞中下调TOX的表达抑制了肿瘤生长，增加了CD8+ T细胞的浸润，减轻了CD8+ T细胞的耗竭，并提高了CD8+ T细胞对抗PD1的反应。这一机制涉及到TOX在细胞质中与PD1的结合，这促进了PD1的内吞再循环，从而在细胞表面保持了丰富的PD1表达。外周CD8+ T细胞中TOX表达的增加与较差的抗PD1反应和预后相关。TOX通过调节PD1的内吞再循环来促进HCC中CD8+ T细胞的耗竭。在CD8+ T细胞中下调TOX的表达与抗PD1疗法协同作用，突出了癌症免疫疗法的一个有希望的策略[6]。

TOX还在哺乳动物大脑皮层的早期发育中发挥作用。在大脑皮层从神经干细胞向神经元和胶质细胞的增殖和分化步骤中，TOX被认为是一个HMG-box转录因子，在早期皮层发育中起着作用[7]。

综上所述，Rhox8是一种在支持细胞中特异性表达的生殖同源框基因，在完整的精子发生和最佳雄性繁殖能力方面起着重要作用。Rhox8与TOX转录因子的表达模式相似，后者在T细胞衰竭中起着关键作用。TOX在Tex细胞形成和维持中起着关键作用，并且是肿瘤特异性T细胞分化的关键调节因子。TOX还在慢性感染中，祖细胞样CD8+ T细胞介导的长期免疫中起着关键作用。TOX在慢性病毒感染中耗竭T细胞表型和寿命的维持中也起着重要作用。TOX还在肝细胞癌中通过防止PD1降解来促进抗肿瘤CD8+ T细胞的耗竭。TOX还在哺乳动物大脑皮层的早期发育中发挥作用。