Rtcb-flox 基因敲除小鼠

Rtcb，也称为RNA 2',3'-cyclic phosphate and 5'-OH ligase（RNA 2',3'-环磷酸和5'-OH连接酶），是一种RNA连接酶，在多种生物过程中发挥着重要作用。Rtcb是tRNA剪接连接酶复合体的催化亚基，负责催化tRNA的剪接，并调节未折叠蛋白反应[2]。此外，Rtcb还可以催化HAC1 mRNA的剪接，参与未折叠蛋白反应途径[6]。Rtcb在细菌中还可以修复抗生素应激后受损的rRNA，加速细胞的恢复过程[9]。Rtcb的表达和功能受到多种因素的调控，例如YY1转录因子可以结合Rtcb的启动子，调节Rtcb的表达[3]。Rtcb在多种疾病中发挥着重要作用，例如流感病毒感染和神经退行性疾病[2][6]。Rtcb的研究有助于深入理解RNA加工和蛋白质稳态在疾病发生和发展中的作用机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。

RNA适配体和基于RNA适配体的设备可以遗传编码并在细胞中表达，以探测和操纵细胞功能。然而，它们在哺乳动物细胞中的实用性受到低表达和快速降解的限制。为了克服这些限制，Litke和Jaffrey（2019）开发了一种名为Tornado的表达系统，该系统利用自催化转录物实现RNA的快速环化，从而产生高稳定性和表达水平的RNA适配体。Tornado表达系统通过在感兴趣RNA的两侧加入Twister核酶，使其迅速进行自催化切割，留下可以被细胞内普遍存在的RNA连接酶RtcB连接的末端。使用这种方法，原本在细胞中效果微弱的蛋白质结合适配体变得能够有效地抑制细胞信号传导。此外，当以线性RNA表达时，RNA基础的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）荧光代谢物生物传感器在细胞中的表达水平较低，但当以环状RNA表达时，其表达水平足以检测细胞内SAM的动态变化[1]。

流感病毒A（IAV）是一种重要的呼吸道病原体，可以导致严重的呼吸道疾病。为了更好地理解IAV的复制机制，Cao等人（2023）研究了RNA剪接连接酶RtcB在IAV复制中的作用。他们发现，RtcB是IAV抑制的宿主因子，在流感病毒感染过程中显著下调，并且其敲除会损害IAV的传播。机制研究表明，RtcB的耗竭导致IAV感染后I型和III型IFN以及促炎细胞因子的水平显著升高，而RtcB的过表达则抑制了这些细胞因子的表达。进一步研究表明，RtcB通过与RNA解旋酶DDX1相互作用，竞争性地抑制DDX21-DDX1的相互作用，从而抑制IFN和下游IFN刺激基因的表达。这些结果表明，RtcB在促进IAV复制中发挥着重要作用，并且RtcB-DDX1的结合相互作用是宿主对抗病毒感染的重要先天免疫调节因子[2]。

在早期胚胎发育过程中，母体和胎儿之间的对话对于胚胎的植入和发育至关重要。Li等人（2021）研究了YY1转录因子和RtcB在母体子宫蜕膜化和胚胎植入中的作用。他们发现，YY1可以结合RtcB启动子的响应元件，并调节RtcB启动子的活性。通过构建多种动物模型，他们的研究表明，YY1和RtcB可能在早期妊娠期间小鼠子宫蜕膜化和胚胎植入中发挥作用[3]。

RNA的环化可以改善RNA的稳定性，然而实现这一目标的简单且可扩展的方法仍然缺乏。为了克服这一挑战，Tong等人（2024）报道了两种促进环状RNA（cRNA）发展的方法：使用II型内含子进行体外环化，以及通过普遍表达的RtcB蛋白进行细胞内环化。他们还报道了简单的纯化方案，能够以高cRNA产率（40-75%）获得高纯度的cRNA，同时保持低免疫反应。这些方法和方案为干细胞工程以及通过锌指蛋白和CRISPR-Cas9进行的强大的基因组和表观基因组靶向提供了便利。值得注意的是，在心肌细胞和神经元中，与线性帽状RNA相比，带有脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点的cRNA具有更高的表达和稳定性，这突出了cRNA在这些非分裂细胞中的实用性。此外，他们还描述了通过cRNA传递的脱免疫Cas9进行的基因组靶向，以及一种用于组合筛选脱免疫蛋白变体的长程多路蛋白工程方法，该方法使cRNA传递蛋白的表达持久性与免疫原性之间具有兼容性。这些cRNA工具集将有助于研究和治疗药物的开发[4]。

RtcB和Archease的协同进化产生了一种多周转RNA连接酶。Desai等人（2015）研究了Archease依赖性和Archease非依赖性RtcB之间的差异，以揭示Archease的进化和功能。他们发现，来自Thermus thermophilus的RtcB只有在Archease存在的情况下才能催化多周转，而来自Thermobifida fusca的RtcB是一种单周转酶，无法被Archease转化为多周转连接酶。这些数据表明，Archease可能进化来支持RtcB的多周转活性，并且两种蛋白质的协同进化对于功能性相互作用是必要的[5]。

帕金森病（PD）是一种常见的神经退行性疾病，其特征是黑质多巴胺能神经元的退化和年龄依赖性α-突触核蛋白（α-syn）蛋白包涵体的形成。Ray等人（2014）通过使用秀丽隐杆线虫进行RNA干扰筛选，发现RtcB-1是α-syn蛋白错误折叠的几个重要修饰因子之一。RtcB-1是蠕虫中人类HSPC117蛋白的直系同源物，后者是哺乳动物神经元中RNA转运颗粒的组成部分。他们发现，RtcB-1可以保护秀丽隐杆线虫的多巴胺能神经元免受由人类α-syn诱导的年龄依赖性退化。此外，神经特异性RNA干扰耗尽rtcb-1增强了α-syn诱导的退化。当线虫暴露于多巴胺神经毒素6-羟基多巴胺时，也获得了类似的结果。最近，HSPC117被鉴定为人类tRNA剪接连接酶复合体的一个必需亚基。tRNA连接酶在RNA修复和非常规mRNA剪接事件中具有替代功能。例如，在酵母中，tRNA连接酶介导HAC1 mRNA的非常规剪接，HAC1是一个控制未折叠蛋白反应（UPR）的转录因子。在秀丽隐杆线虫中，他们证明了RtcB-1对于xbp-1 mRNA的剪接是必需的。此外，使用RNA连接酶失活突变体，他们确定了蠕虫RtcB-1的连接酶活性对于其神经保护作用是必需的，后者通过UPR途径中的XBP-1介导。这些研究强调了RNA加工和蛋白质稳态在介导神经保护中的机制交叉[6]。

铜绿假单胞菌是一种机会性病原体，是免疫受损个体、囊性纤维化患者和烧伤受害者感染的重要原因。为了其生存，当感染宿主时，该细菌会适应游动或固着的生活方式。游动细菌通常具有活化的III型分泌系统（T3SS），对宿主具有致病性，而固着细菌则具有活化的VI型分泌系统（T6SS）并生活在生物膜中。涉及Gac-Rsm或次级信使如c-di-GMP的调节途径决定了哪种生活方式对铜绿假单胞菌更有利。Dadashi等人（2021）将RNA结合蛋白RtcB引入为调节游动和固着细菌生活方式之间转换的调节因子。使用野生型铜绿假单胞菌PAO1和T3SS受抑制而T6SS活化的retS突变体PAO1(∆retS)，他们发现删除rtcB导致在PAO1(∆rtcB)和PAO1(∆rtcB∆retS)中同时表达T3SS和T6SS。删除rtcB还增加了PAO1(∆rtcB)的生物膜形成，并恢复了PAO1(∆rtcB∆retS)的游动性。RNA测序数据表明，RtcB是一个影响多种毒力因子的全局调节因子，包括细菌分泌系统。竞争性杀灭和感染实验表明，PAO1(∆rtcB)中的三个T6SS系统（H1、H2和H3）被激活成功能性注射器，并可以与大肠杆菌竞争并有效地感染生菜。Western印迹和RT-PCR结果表明，RtcB可能通过RsmA在PAO1(∆rtcB∆retS)中发挥其功能。c-di-GMP的定量表明，PAO1(∆rtcB)中细胞内水平升高，这可能导致T6SS和T3SS之间的转换，并导致观察到的表型和特性的改变。他们的数据表明，RtcB在铜绿假单胞菌的毒力中起着关键作用，通过控制多种毒力决定因子，如生物膜形成、游动性、绿脓菌素产生、T3SS和T6SS分泌系统，影响真核和原核细胞。这些发现表明，RtcB是控制铜绿假单胞菌定植、建立和致病性的潜在靶点[7]。

RNA连接酶RtcB是一种新型的RNA连接酶，可以将2',3'-环磷酸和5'-OH末端连接起来。RtcB的进化分布表明它可能是一种tRNA剪接/修复酶。Tanaka等人（2011）表明，大肠杆菌RtcB在体内具有足够的tRNA剪接能力，因为它能够互补缺乏内源性“愈合/密封型”tRNA连接酶Trl1的酵母细胞的生长。RtcB还可以保护酵母trl1Δ细胞免受一种真菌核糖毒素的侵害，该毒素切割细胞tRNA的反密码环。此外，RtcB可以在未折叠蛋白反应期间取代Trl1作为HAC1 mRNA剪接的催化剂。因此，RtcB是一种真正的RNA修复酶，具有广泛的生理作用。RtcB的生化分析突出了其活性位点和催化机制的独特性。他们的发现将tRNA连接酶作为有希望的药物靶点[8]。

RtcB是一种高度保守的RNA连接酶，存在于所有三个生命领域，并且在古菌和动物中是tRNA剪接的必需成分。然而，在细菌中，RtcB的生物功能仍然不清楚，因为细菌中不存在剪接。Manwar等人（2019）首先进行了生物信息学分析，揭示了细菌中RtcB高度保守的结构和可能保守的功能。然而，其同源物仅在约0.5%的细菌物种中存在，这些物种分布在不同的门，并且具有频繁的水平转移的显著信号，这突出了它在细菌中的非必需作用。通过构建一个rtcB敲除菌株，他们发现去除抗生素应激会显著影响野生型菌株中rtcB的表达，并且RtcB的耗竭（ARtcB菌株）会延迟恢复过程。他们的转录组分析，包括RNA的3'-端标记，强调了在Δ RtcB菌株中，特别是在恢复期间，未映射读取和切割rRNA的显著增加。他们的观察表明，保守的RNA连接酶RtcB在应激释放后修复受损的rRNA，这可以节省能量并加速其宿主的恢复。他们认为，不同细菌类群获得RtcB为在应激条件下提供了竞争优势[9]。

综上所述，Rtcb是一种重要的RNA连接酶，在多种生物过程中发挥着重要作用。Rtcb在RNA加工、蛋白质稳态和疾病发生中发挥着重要作用，并且在多种疾病中具有潜在的治疗价值。Rtcb的研究有助于深入理解RNA加工和蛋白质稳态在疾病发生和发展中的作用机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。