Slc39a12-flox 基因敲除小鼠

Slc39a12基因编码锌转运蛋白ZIP12，广泛表达于多种组织，在脊椎动物中枢神经系统中含量丰富。ZIP12的功能是将锌转运穿过细胞膜，包括从细胞外向细胞内的锌流入。全基因组关联和外显子组测序研究显示，大脑敏感性加权磁共振成像（MRI）强度与ZIP12基因的多态性和罕见突变相关。ZIP12对于非洲爪蟾（Xenopus tropicalis）的神经管闭合和胚胎发育至关重要。缺乏ZIP12的非洲爪蟾胚胎会出现前神经管缺陷并失去生命力。ZIP12对于小鼠神经细胞中的轴突生长和线粒体功能也至关重要。ZIP12 mRNA在精神分裂症患者的大脑区域增加。除了神经系统外，缺氧可诱导多种哺乳动物（包括人类）中的ZIP12表达，导致肺内皮和平滑肌增厚，进而导致肺动脉高压。其他研究还发现ZIP12与癌症等其他疾病相关。鉴于ZIP12在大脑中高度表达，并且敏感性加权MRI与大脑金属含量相关，ZIP12可能影响神经系统和精神疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病和精神分裂症。此外，在病理生理条件下诱导ZIP12和随后的锌摄取可能是疾病病理学的重要成分，如肺动脉高压。与金属（如锌）结合的药物化合物可能能够治疗与锌稳态受损和ZIP12功能改变相关的疾病[1]。

锌对正常大脑发育至关重要。已有研究指出，原发性锌缺乏和继发性锌缺乏可能导致多种人类出生缺陷的发生，包括许多涉及中枢神经系统的缺陷。在最近的一项研究中，研究者们寻找对神经发育至关重要的锌转运蛋白基因。他们证实ZIP12是一种锌转运蛋白，由slc39a12基因编码，在人类、小鼠和青蛙（Xenopus tropicalis）的中枢神经系统中高度表达。通过功能丧失的方法，他们确定ZIP12对于神经元的分化和轴突生长至关重要，对于神经管的形成和胚胎的存活也是必要的。这些结果表明，在胚胎发生和神经系统发育过程中，锌的调节至关重要。他们提出slc39a12是导致人类遗传性神经发育缺陷的候选基因[2]。

锌转运蛋白ZIP12，由slc39a12基因编码，已在小鼠神经母细胞瘤细胞和小鼠原代神经元中被证明对神经元分化至关重要，并且在非洲爪蟾胚胎发生过程中神经管的形成中也是必要的。然而，关于该基因的生化特性、细胞调节或生理作用知之甚少。ZIP12作为锌转运蛋白对神经系统功能和发育的重要性假设指导了一个比较遗传学方法，以揭示各种基因组中ZIP12的存在，并确定与ZIP12相关的保守序列和表达模式。使用人类ZIP12氨基酸序列与人类旁系同源基因ZIP4的比较，以及基因组之间的保守局部同线，进行了slc39a12的直系同源检测。ZIP12存在于几乎所有检查的脊椎动物基因组中，从人类和其他哺乳动物到大多数硬骨鱼。然而，ZIP12似乎在斑马鱼基因组中缺失。与ZIP4相比，在其他无脊椎动物脊索动物和后口动物中鉴别ZIP12是失败的或不确定的。由于包含或排除保守外显子而引起的剪接变体在人类、大鼠和牛中存在，并且可能具有生物学意义。ZIP12还拥有许多假定的二亮氨酸和酪氨酸基序，这些基序通常与细胞内转运相关，可能通过ZIP12在细胞内的定位控制细胞锌摄取活性。这些发现突出了ZIP12在生化、细胞和生理水平上的多个方面，可能具有生物学意义。ZIP12似乎在脊椎动物神经系统发育中作为锌摄取转运蛋白具有保守功能。因此，ZIP12的作用可能是导致各种动物模型和人类中锌缺乏引起的先天性畸形的潜在重要因素[3]。

一项旨在研究溶质载体（SLC）基因在遗传性视网膜疾病（IRDs）中的临床和遗传方面的研究发现，在913例IRDs外显子组测序样本的433个SLC基因中，发现了6个SLC基因中的纯合致病突变，包括2个候选新基因，其中slc39a12基因中的变异导致常染色体隐性广泛视网膜变性伴明显黄斑受累。此外，该研究还报告了4个ARRP家族，其中slc37a3基因中有纯合无效变异，而slc4a7基因中的c.2007dup变异在2例ARRP患者中发现，导致蛋白质缺失。最后，slc24a1基因中的变异在4例ARRP或先天性静止性夜盲症患者中发现。该研究将slc66a1和slc39a12确定为候选IRDs基因，证实了slc37a3的致病性，并为slc4a7作为IRDs基因提供了更多证据。该研究扩展了slc24a1的表型范围，并认为其ARRP表型可能比之前报道的更为常见[4]。

在颞下颌关节骨关节炎（TMJ-OA）与情绪障碍之间已有明显关联的研究中，研究者观察到大鼠颞下颌关节骨关节炎模型中注射MIA后的行为变化和颞下颌关节区域的海马组织病理变化。通过建立颞下颌关节骨关节炎模型来评估颞下颌关节区域的HWT，并使用OFT和EPM对大鼠进行评估。使用HE、O-快绿染色、qRT-PCR和免疫荧光检测突触损伤。检测血清和海马神经元中的氧化应激水平。使用H2O2、ZnCl2和siRNA转染HT22细胞，研究了RNA-Seq获得的基因的功能。注射MIA导致大鼠颞下颌关节表面的软骨细胞层紊乱，突触软骨基质的合成减少、降解增加，HWT降低。OFT和EPM的结果显示，MIA组的大鼠在MIA注射的第6周出现了焦虑样行为。在MIA组的血清和海马神经元中检测到Nox4表达增加，SOD2表达减少，MDA水平升高，GSH水平降低，神经元出现核固缩和Nissl小体减少。MIA组大鼠海马神经元中的Slc39a12表达降低。在HT22细胞中敲低Slc39a12导致Nox4表达增加，SOD2表达减少，MDA水平升高，GSH和细胞内Zn2+减少。在转染和H2O2刺激后，添加ZnCl2可逆转HT22细胞中的氧化应激。海马神经元中Slc39a12的缺失导致细胞氧化应激，进而导致神经元损伤。这可能是颞下颌关节骨关节炎在大鼠中引发焦虑样行为的原因[5]。

在一项关于中国和北欧奶牛的GWAS研究中，CACNB2、SLC39A12和ZEB1基因被提出为繁殖的候选基因。本研究对这些关联进行了验证，并在一个具有9种繁殖性状记录的独立种群中进行了功能研究。更重要的是，通过使用卵巢卵泡的表达数据，验证了这些基因在繁殖过程中的功能。首先在68头中国荷斯坦公牛中检测到这三个基因中的潜在变异，然后使用KASP（竞争性等位基因特异性PCR）方法在1588头中国荷斯坦母牛中进行筛选。CACNB2中有9个变异具有多态性，SLC39A12中有5个，ZEB1中有4个，其中CACNB2上游调控区有1个SNP，外显子区有2个，下游调控区有4个，内含子区有11个SNP。在这18个变异中，CACNB2中的g.33267056T/G解释了初产年龄（0.011%）、第一胎到最后一胎的间隔（0.004%）和分娩难易度（0.002%）的最大表型方差，而SLC39A12中的g.32751518G/A对母牛的死产率贡献最大（0.038%）。为CACNB2构建了两个单倍型块，为SLC39A12和ZEB1各构建了一个单倍型块，这些单倍型块与5种繁殖性状显著相关，包括首次配种年龄、首次分娩年龄、母牛和母牛的分娩难易度以及分娩到首次配种的间隔。然后研究了从8头奶牛的4个发育阶段的卵巢卵泡中分离的颗粒细胞基因表达谱。所有三个基因在卵巢卵泡的大小不同时都表现出差异表达（p < 0.05），这表明它们可能在奶牛的繁殖过程中发挥作用。本研究成功证实了三个BTA 13基因CACNB2、SLC39A12和ZEB1与繁殖的关联，并进一步直接检查了它们在卵巢卵泡中的表达水平。这些发现对于正在进行繁殖性状基因选择程序是有益的，这些性状长期以来被认为是由于缺乏有效的遗传标记而难以实现遗传改良的性状[6]。

成年哺乳动物肺循环对低氧环境的典型反应是肺动脉的血管收缩和结构重塑，导致慢性肺动脉高压和右心室肥厚。然而，一些哺乳动物表现出对低氧诱导的肺动脉高压的遗传抵抗。研究者们使用近交系育种计划和比较基因组学利用了这种在鼠和大鼠中的变异，并确定了基因Slc39a12作为低氧诱导的肺血管重塑的主要调节因子。Slc39a12编码锌转运蛋白ZIP12。本研究报道了ZIP12表达在易感低氧诱导的肺动脉高压的鼠、牛和人类的重塑肺动脉中多种细胞类型（包括内皮细胞、平滑肌细胞和间质细胞）中增加。他们表明，肺血管平滑肌细胞中的ZIP12表达是低氧依赖性的，并且靶向抑制ZIP12可抑制低氧暴露的肺血管平滑肌细胞中细胞内可溶性锌的增加以及它们在培养中的增殖。他们证明，Slc39a12表达的遗传破坏减弱了在低氧环境中饲养的大鼠肺动脉高压的发展。这一新的、意外的关于锌转运蛋白在哺乳动物肺血管稳态中的基本作用的见解，为肺动脉高压的药物管理提供了一个新的药物靶点[7]。

锌是神经元结构和功能许多方面的必需元素。然而，神经系统中的锌调节仍然知之甚少。对组织谱微阵列数据的系统分析表明，锌转运蛋白ZIP12（slc39a12）在人类大脑中高度表达。在本研究中，研究者们证实ZIP12是一种Zn2+摄取转运蛋白，在鼠和非洲爪蟾的神经系统中具有保守的高表达模式。ZIP12敲低后，小鼠神经元和神经母细胞瘤细胞产生的轴突更少、更短，而不会影响细胞活力。在细胞中通过锌螯合或加载锌来改变锌的可用性，分别模拟或减少了ZIP12敲低对轴突生长的影响。ZIP12敲低降低了cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的活化和在丝氨酸133处的磷酸化，这是神经元分化的关键途径。持续的CREB激活恢复了由锌螯合或ZIP12敲低引起的轴突生长受损。ZIP12敲低还降低了微管聚合，并增加了轴突生长后对诺考达唑的敏感性。他们发现，在非洲爪蟾的神经管形成和早期神经系统发育过程中，ZIP12表达。ZIP12反义形态素敲低导致神经管闭合受损，并在神经管形成过程中发育停滞，同时神经板中微管聚合减少。这项研究确定了一种Zn2+转运蛋白，它对神经系统发育是必需的，并为Zn2+、神经管形成和神经元分化之间提供了有形的联系[8]。

锌转运蛋白（ZIP和ZnT）、金属硫蛋白（MT）和蛋白激酶CK2参与乳腺癌和前列腺癌细胞中锌稳态的失调。继之前的研究，本研究针对ZIP12、ZnT1、MT2A和CK2进行研究，通过qRT-PCR和免疫荧光共聚焦显微镜检测了在无或存在细胞外锌暴露的情况下，ZIP12、ZnT1、MT2A和CK2亚基在一系列乳腺癌和前列腺细胞系中的表达水平。同时，通过免疫荧光共聚焦显微镜检测了这些靶蛋白的细胞定位。在细胞外锌暴露后，正常前列腺上皮细胞（RWPE-1）中SLC39A12（ZIP12）、SLC30A1（ZnT1）和MT2A（MT2A）的基因表达升高，而其癌细胞（PC3和DU145）中的基因表达则较低。在正常（MCF10A）和基底乳腺癌细胞（MDA-MB-231）中，SLC39A12（ZIP12）和SLC30A1（ZnT1）的基因表达高于管腔乳腺癌细胞（MCF-7）。在蛋白水平上，ZIP12和ZnT1在乳腺癌细胞中的表达随时间推移呈下降趋势，而在正常乳腺上皮细胞中保持恒定。前列腺癌细胞中的ZIP12表达高于正常前列腺细胞。CK2α/α'和CK2β在前列腺癌细胞中的表达明显比正常前列腺细胞高。在细胞外锌暴露后，ZIP12首次在乳腺癌细胞的质膜中明显定位，但在正常乳腺上皮细胞和前列腺细胞中则不是。ZnT1仅定位在乳腺癌细胞的质膜中。MT2A在乳腺癌细胞中靠近质膜。CK2也首次显示定位在乳腺癌细胞质膜附近。这些发现，特别是ZIP12和CK2的定位，对于理解乳腺癌和前列腺癌细胞中的锌稳态具有重要意义[9]。

综上所述，Slc39a12基因编码的锌转运蛋白ZIP12在多种生物学过程中发挥重要作用。ZIP12对于神经系统发育至关重要，其表达和功能与多种神经系统和精神疾病相关，如帕金森病、阿尔茨海默病和精神分裂症。ZIP12的异常表达与癌症的发生和发展有关，如乳腺癌和前列腺癌。ZIP12在肺动脉高压的发展中也起着重要作用，可能是治疗该疾病的潜在药物靶点。ZIP12的研究有助于深入理解锌转运蛋白在维持锌稳态和调节多种生物学过程中的作用，为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。